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熊胆是一种传统的珍稀药材,是棕熊或黑熊的胆囊。熊去氧胆酸（UDCA）是熊胆的主要药用成分,其与牛磺酸结合形成牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）,TUDCA被广泛应用于各种肝胆疾病的治疗。目前TUDCA主要是通过熊胆引流或化学合成的方法来获取,但这两种方法对生态和环境不友好。随着生物技术和工程技术的融合发展,应用生物催化技术来大规模制备TUDCA将成为可能。本课题组前期发现,在体外,可以以7α-HSDH为催化剂催化TCDCA发生7α-脱氢生成T7-KLCA,再进一步以7β-HSDH为催化剂催化T7-KLCA加氢而生成TUDCA。因此,7α-HSDH是体外应用生物催化技术制备TUDCA的关键酶之一。7α-HSDH的热稳定性和催化活性是决定其能否适应工业化生产的关键因素。本文以获取热稳定性好,催化活性高的7α-HSDH为目的,在黑熊肠道微生物宏基因组数据库中获得了一个新的7α-HSDH（命名为St-2-2）,系统的研究了St-2-2的酶学性质。基于生物信息学分析,进一步对其羧基端进行了分子改造,获得了热稳定性与活性都提高的突变体,并初步探讨了突变体I255Q热稳定性提高的原因。本研究扩展了7α-HSDH的天然酶库,为应用生物催化技术大规模制备TUDCA提供了新的资源。主要研究结果和结论如下:（1）基于本课题组前期获得的黑熊肠道微生物宏基因组数据库,本文挖掘了一个新的7α-HSDH,命名为St-2-2。1)粒径排阻色谱和质谱分析表明St-2-2是由28.3 kDa的亚基构成的四聚体（113.2 kDa）。2)对其催化活性研究发现,St-2-2对TCDCA、GCDCA、TCA、GCA的催化活性显著优于本课题组前期发现的5个7α-HSDHs。其中,St-2-2对TCDCA的催化活性显著高于S1-a-1（p<0.01）、S1-a-2（p<0.05）、H1-a-1（p<0.001）、H1-a-2（p<0.001）和Y1-a-1（p<0.001）,其活性分别是它们的1.7倍、1.2倍、10.3倍、15.8倍、13.7倍。从催化活性上看,St-2-2在生物合成TUDCA上具有显著的优势。（2）以TCDCA为底物,对St-2-2的酶学性质进行了系统研究。1)St-2-2最适pH研究显示其在pH为10.0时显示出最佳酶活,表明其为嗜碱酶。2)St-2-2最适温度研究显示其在温度为35oC时显示出最佳酶活,表明其为嗜温酶。3)St-2-2的热稳定性研究显示,St-2-2在4oC处理80 h仍保留65.4%的酶活。St-2-2在37oC环境中的热稳定性显著优于实验室前期发现的5个7α-HSDHs。St-2-2在37oC处理30 h仍保留65.5%的酶活,而S1-a-1、Y1-a-1在同等条件下完全失去活性,而S1-a-2、H1-a-1、H1-a-2在同等条件下的残余酶活分别为51.2%、38.9%、40.1%。4)金属离子对St-2-2酶活的影响研究表明Na+,Mg2+在适当的浓度下对St-2-2的酶活具有激活作用。当Na+浓度达到5 mM时可使酶活增加14.3%,当Mg2+达到2.5 mM时可使酶活增加30.5%;当Cu2+、Mn2+浓度分别达到5 mM、50 mM时出现了显著的酶活抑制现象（p<0.001）,对应的酶活分别降低至8.8%和34.2%;K+对St-2-2的酶活无显著影响。酶学性质的研究为St-2-2的后续研究和应用提供了数据参考。（3）基于生物信息学分析,本文对St-2-2的羧基端进行了分子改造,获得了6个突变型St-2-2。1)酶的活性研究结果表明,6个突变体都具有酶活。其中,突变体I255Q对TCDCA、GCDCA的催化活性显著提高（p<0.001）,分别是St-2-2酶活的2.7倍和2.2倍;相反对GCA和TCA的催化活性显著降低（p<0.001）,其酶活分别降低至15.7%和33.1%。与野生型St-2-2的活性相比,突变体K262R/K261Q/A259L对于TCDCA和GCDCA的催化活性无显著差异,但是对GCA、TCA的催化活性显著提高（p<0.001）,是St-2-2活性的2.0倍和1.8倍。2)对突变型St-2-2的热稳定和Tm值的研究发现,突变体K262R、A259L、I255Q、K262R/K261Q/A259L的热稳定性和Tm值相对于野生型St-2-2都有所提高。其中I255Q的热稳定性和Tm值相比于野生型St-2-2显著提高。野生型St-2-2在50oC处理30 min保留76.2%的酶活,而突变体I255Q在相同条件下仍保留96.9%的酶活,其相应的Tm也提高了7.8oC。同样的,突变体K262R/K261Q/A259L在相同条件下仍保留86.1%的酶活,其相应的Tm值提高了1.7oC。活性和热稳定性提高的突变体的获得为应用生物催化技术大规模制备TUDCA提供了新的资源。（4）应用SWISS-MODEL对野生型St-2-2和突变体I255Q进行三维结构同源建模,并用PyMOL针对二者的255位进行了分子间作用力分析。结果显示突变体I255Q的Gln-255位与Ser-253位产生了一个氢键的结合,而野生型St-2-2的Ile-255位与Ser-253位并没有产生这样的结合。而氢键是稳定蛋白结构的重要作用力,所以,这样的变化增加了蛋白质分子链的稳定性,从而增加了突变体I255Q的稳定性。圆二色谱对二者二级结构的检测结果显示突变体I255Q相对于St-2-2的二级结构,突变体I255Q的α-螺旋含量减少了15.5%,而β-折叠的含量增加了12.4%。在蛋白质的结构和功能的关系中,α-螺旋含量减少,β-折叠增加有助于稳定蛋白的结构。以上结果表明突变体I255Q的Gln-255位与Ser-253位氢键的形成以及突变后二级结构含量的变化是突变体I255Q热稳定性提高的原因。