失重状态下骨丧失的原因探讨和防治一直以来是学者们关注的热点问题。然而,目前科学家们对失重性骨丧失的研究主要集中在下肢长骨的研究,而对于全身骨骼中代谢最活跃的骨组织-牙槽骨的研究却罕见报道。骨,一直以来都是口腔医学领域的重点研究课题之一,牙槽骨具有支持和稳固牙齿的作用,其代谢、吸收及缺损等与众多口腔疾病的发生密切相关。与长骨相比,牙槽骨为非承重骨,受失重这一力学刺激影响较小,但其骨代谢水平受激素和钙、磷离子等水平变化的影响大。本课题组在前期研究中发现,小鼠悬尾后后肢骨骨丧失明显,并且血磷水平升高。近年来,无机磷不仅是羟基磷灰石结晶必需成分,而且作为“细胞外信号分子”参与骨矿化,具有调节基因转录和细胞功能的作用,受到了学者越来越广泛的关注。那么,骨代谢最活跃的牙槽骨在失重环境下是否和长骨一样也存在骨丧失?如果存在,是否与失重引起的异常磷代谢相关?这些问题是本课题关注的问题。近些年来,随着多种骨细胞系和骨细胞特异性转基因小鼠模型的建立,骨细胞生物学功能的研究受到学者们越来越广泛的关注和研究。研究表明骨细胞是调节破骨细胞和成骨细胞活性分子的主要来源,如硬化蛋白(Sclerostin,SOST)和核因子кB受体活化因子配体(Receptor Activator of NF-кB Ligand,RANKL)。同时研究显示核因子кB受体活化因子(Receptor Activator of NF-кB,RANK)、RANKL和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)这些因子的功能丧失和作用紊乱将引起许多代谢性骨病,如RANKL/OPG升高与牙槽骨吸收密切相关。对SOST-OPG-RANKL-RANK系统的作用及调控机制进行深入研究,可能为代谢相关性骨病提供新的治疗途径。那么,如果异常磷代谢与模拟失重下牙槽骨骨丧失相关的话,SOST-OPG-RANKL-RANK系统是否参与其中作用?如果对模拟失重悬尾鼠以低磷食物喂养为干预措施,能否对其牙槽骨骨丧失起到预防作用?本课题也会重点研究这些问题。本课题共分为三部分。第一部分实验通过悬尾鼠模拟失重实验和高磷食物喂养鼠实验进行体内研究,来证实磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失是否具有相关性。第二部分实验通过细胞回转器回转骨细胞模拟失重实验和高磷培养液培养骨细胞实验进行体外研究,进一步研究磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失的相关性;同时实验还将探讨SOST-OPG-RANKL-RANK系统是否参与其中作用?第三部分实验通过对模拟失重悬尾鼠进行低磷食物喂养干预,探讨其对模拟失重下牙槽骨骨丧失可能的预防作用。一、磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失相关性的体内研究研究目的利用悬尾鼠及高磷喂养鼠模型模拟失重环境和高磷环境,探讨其对实验鼠牙槽骨骨改建的影响及与磷代谢异常的相关性。实验方法1.利用尾部悬吊法造失重模型,实验分为对照(control,CON)组和悬尾(tail-suspension,SUS)组。通过微计算机断层扫描(micro computed tomography,Micro-CT)精确观察下颌磨牙牙槽骨骨小梁改建情况,同时进行三维重建参数定量分析;通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察牙槽骨断面立体微结构改变。利用丽春红三色染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)染色分别用来检测牙槽骨新生骨生成情况、破骨和成骨细胞数及活性。利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记技术(TDT-mediated d UTP nick-end labeling,TUNEL)凋亡检测法检测骨细胞凋亡情况,免疫组化染色技术检测牙槽骨骨细胞SOST的表达情况,血清学检测血磷水平。2.利用高磷食物喂养法造高血磷模型,实验分为对照(CON)组和(high phosphate diet,HPi)高磷组。通过Micro-CT观察高磷鼠牙槽骨骨小梁改建情况并进行定量分析,通过扫描电镜观察牙槽骨失状正中面感兴趣区域立体微结构的改变,血清学检测血磷水平。实验结果1.悬尾模拟失重鼠实验结果:悬尾鼠磨牙牙槽骨存在骨质丧失,骨小梁较稀疏、变细及感兴趣区域平均骨密度降低。断面立体微结构可见骨细胞形态发生改变,骨陷窝增大,骨胶原纤维相互间交联杂乱。染色结果显示牙槽骨新生骨减少,TRAP阳性细胞数增多,ALP阳性细胞数减少,提示骨吸收大于骨形成。TUNEL凋亡检测到阳性颗粒骨细胞数增多,免疫组织化学染色结果表明骨形成抑制蛋白SOST在骨细胞中表达增强。悬尾组血磷值较地面对照组血磷值升高。2.高磷食物喂养鼠实验结果:高磷组血磷值较正常食物对照组血磷值升高,表明高血磷模型造模成功。Micro-CT骨小梁微结构三维重建后显示与对照组比较,高磷鼠第一磨牙根分叉区牙槽骨有骨丧失,骨小梁形态结构也发生改变。断面立体微结构可见高磷组骨细胞形态发生改变,骨陷窝增大,周围突起断裂,骨基质相对疏松。高磷组牙槽骨骨胶原纤维结构变杂乱,走向不一致,不能形成排列有序、形态规整的纤维束。高磷鼠实验结果与悬尾鼠实验结果一致。研究结论1.模拟失重悬尾鼠牙槽骨存在一定程度的骨丧失,同时血磷水平升高。而高磷食物喂养的实验鼠血磷升高,牙槽骨也存在骨丧失。体内实验表明磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失具有相关性。2.牙槽骨骨细胞形态学和生物学功能的改变,提示深入研究模拟失重环境与高磷环境下骨细胞的生物学作用将是阐明牙槽骨骨丧失机制的重要切入点。3.由于动物实验的局限性,本研究结论尚需骨细胞体外培养实验进一步验证。二、磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失相关性的体外研究研究目的利用细胞回转器及高磷培养液体外培养骨细胞模拟失重环境和高磷环境,探讨其对骨细胞生物学功能的影响及与磷代谢异常的相关性。并进一步探究SOST-OPG-RANKL-RANK系统在模拟失重下牙槽骨骨丧失中的作用。实验方法IDG-SW3骨细胞系体外培养,利用细胞回转器模拟失重环境,实验分为对照(CON)组和细胞回转模拟失重(microgravity,MG)组;利用高磷培养液模拟高磷环境,实验分为对照(CON)组和高磷液培养(high inorganic phosphorus medium,HPi)组。骨细胞透射电镜(transmission electron microscope,TEM)下观察各组骨细胞形态学改变;实时定量逆转录酶聚合酶链反应(real-time reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction,real time-PCR)技术检测各组骨细胞SOST、RANKL和OPG m RNA的相对表达量。实验结果透射电镜下观察回转组骨细胞和高磷组骨细胞较对照组骨细胞形态发生明显改变,呈凋亡像,可见凋亡小体。Real time-PCR检测结果显示,细胞回转模拟失重组骨细胞中SOST和RANKL m RNA表达上调、OPG m RNA表达下降、RANKL/OPG比率升高。高磷液培养骨细胞实验结果与细胞回转模拟失重骨细胞实验结果一致。研究结论1.细胞回转器回转模拟失重可使骨细胞形态发生改变,呈凋亡像;而高磷培养液培养的骨细胞形态也发生凋亡改变。体外实验也表明磷代谢异常与模拟失重下牙槽骨骨丧失具有相关性。2.骨细胞SOST m RNA表达上调,RANKL/OPG比率升高。提示高磷环境与模拟失重环境下骨细胞可能通过SOST-OPG-RANKL-RANK系统发挥作用,进一步调控破骨细胞和成骨细胞活性,导致骨丧失。三、低磷食物对模拟失重下牙槽骨骨丧失预防作用的实验研究研究目的探讨低磷食物喂养对悬尾模拟失重鼠牙槽骨骨丧失的预防作用。实验方法利用尾吊法造模拟失重模型,以低磷食物作为干预措施。实验分为对照(CON)组、悬尾(SUS)组和悬尾低磷(tail-suspension with low Pi diet,SUS-LP)组。通过Micro-CT精确观察牙槽骨骨小梁改建情况并进行定量分析。利用丽春红三色染色、TRAP染色、ALP染色分别用来检测牙槽骨新生骨生成情况、破骨和成骨细胞数及活性。实验结果Micro-CT三维重建后悬尾组与对照组比较,牙槽骨的骨质丧失明显,骨小梁变稀疏、变细及感兴趣区域平均骨密度降低;悬尾低磷组与悬尾组比较,骨小梁数目增多,小梁间距较紧密,其立体网状结构连续性较好。组织染色结果显示,悬尾组与对照组比较,显示牙槽骨新生骨生成减少,TRAP阳性细胞数增多,ALP阳性细胞数减少,提示骨吸收大于骨形成;悬尾低磷组较悬尾组新生骨基质生成增多(红染区域),牙槽骨TRAP阳性细胞数减少,ALP阳性细胞数增多,提示骨形成增加。研究结论低磷食物对悬尾模拟失重实验鼠进行干预后,牙槽骨骨丧失减少。本实验初步证实了低磷食物干预对模拟失重下牙槽骨骨丧失有一定的预防作用。