目的:脊髓损伤(SCI)是一种临床治疗效果较差且难度巨大的外科疾病。全世界范围内,每年有大量脊髓损伤新发病例,其中很多是青壮年,在其人生最活跃的时期发生脊髓损伤。患者丧失其活动能力,尿便失禁,失去生活自理能力,给家庭和社会带来沉重的心理负担和经济损失。黄连素是中国传统中药,用于治疗炎症性腹泻已应用千年。近年来,关于黄连素研究取得巨大进展,黄连素具有抗炎,抗糖尿病,抗肿瘤等多种生物学效应。在急性脑损伤,神经退行性阿尔茨海默病,亨廷顿等中枢神经系统疾病中具有神经保护作用。黄连素在急性脊髓损伤中的神经保护机制有待进一步研究,黄连素口服的安全性及其低廉的制作成本将给脊髓损伤患者带来福音。研究其在脊髓损伤中的作用机制及治疗效果具有巨大的临床意义。本研究通过体内体外实验探究黄连素对脊髓损伤修复的神经保护作用及机制。材料与方法:1.第一部分选取60只雄性SD大鼠,体重范围200-250mg,将大鼠分为假手术组(给予椎板切除术);脊髓损伤组(选择10g打击器25mm高处打击,打击后,脊髓出血红肿明显,当即下肢抽搐,造模成功,术后给予等量生理盐水);脊髓损伤+黄连素组(黄连素混合0.9%生理盐水配制),以10mg/kg浓度脊髓损伤后连续腹腔注射给药3天。观察脊髓损伤后3天,7天,21天,60天,黄连素对脊髓损伤大鼠神经行为学恢复的影响。通过检测脊髓损伤1天,2天,3天脊髓损伤区域干湿重方法,评估脊髓水肿程度。通过BBB评分评价脊髓损伤大鼠运动功能。收集脊髓损伤3天SCI大鼠的脑脊液,ELISA检测脑脊液中前炎症因子TNF-α和IL-1β的含量。收集脊髓损伤3天后SCI大鼠损伤部位脊髓组织,提取上清液,q-PCR检测炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达。2.第二部分通过Western blot检测脊髓损伤7天后,损伤部位脊髓组织中自噬相关蛋白LC3B,ATG16L,ATG7及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达。免疫荧光共定位检测脊髓损伤3天后,自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达并统计相对表达量,免疫荧光观察脊髓损伤7天后,少突胶质细胞标志物CNPase和自噬相关蛋白ATG5表达。统计CNPase阳性表达细胞,自噬相关蛋白ATG5阳性表达细胞,和CNPase/ATG5双阳性表达神经细胞数目。通过尼氏染色观察脊髓损伤前角神经元表达,并计算神经细胞数量,统计脊髓损伤中心区域剩余白质面积百分比。3.第三部分取出生1天内的乳鼠,取其脊髓组织,提取原代脊髓神经细胞做培养,脂多糖诱导神经细胞炎症反应模型,实验分组分为:正常对照组;脂多糖组;脂多糖+黄连素组;脂多糖+黄连素+3-MA组。脂多糖诱导6小时后给予10uM黄连素及5uM 3-MA处理。选用MTT法检测细胞生存率。TUNEL染色观察脂多糖组及黄连素处理组细胞凋亡情况。通过转染沉默Beclin1,通过Western blot观察自噬蛋白Beclin1和ATG12表达。4.第四部分进一步探究黄连素诱导自噬的机制,我们通过Western blot观察mTOR通路相关蛋白p70s6k,p-mTOR表达。实验分组分为:正常对照组;脂多糖处理组;脂多糖+黄连素组。统计p70s6k及p-mTOR相对表达量。结果:第一部分黄连素减轻了脊髓损伤后炎症反应促进了神经功能恢复1.黄连素组对比脊髓损伤组明显减轻了脊髓水肿。2.SD大鼠改良Allen脊髓损伤模型建模成功,术后大鼠后肢瘫痪,后肢活动受限。在脊髓损伤7天,21天,60天,给予黄连素组对比脊髓损伤组神经行为学BBB评分明显提高。3.通过ELISA检测脊髓损伤3天脑脊液中炎症因子TNF-α,IL-1β含量,发现黄连素组明显降低了脑脊液中炎症因子TNF-α和IL-1β含量。4.通过q-PCR检测炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达,发现黄连素组减少了脊髓损伤部位的炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达。第二部分黄连素诱导了少突胶质细胞自噬减轻了脊髓损伤炎症反应1.在脊髓损伤7天,脊髓损伤组对比假手术组,自噬相关蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达明显增高,黄连素组对比脊髓损伤组,进一步促进了自噬相关蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7表达,减轻了cleaved caspase-3表达。2.脊髓损伤3天后,免疫荧光发现脊髓损伤后自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达激活,黄连素组进一步促进了自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达。3.免疫荧光发现,在假手术组和脊髓损伤组中都存在CNPase和ATG5阳性神经细胞表达。脊髓损伤1周后,脊髓损伤组CNPase阳性神经细胞荧光强度对比假手术组明显降低,黄连素组对比脊髓损伤组明显促进了CNPase阳性神经细胞表达。脊髓损伤1周后,黄连素处理组对比脊髓损伤组ATG5阳性神经细胞荧光强度没有统计学意义。脊髓损伤组对比假手术组CNPase/ATG5双阳性神经细胞明显提高,提示少突胶质细胞自噬的激活,黄连素组对比脊髓损伤组进一步促进了CNPase/ATG5双阳性神经细胞表达。4.在脊髓损伤2周后,尼氏染色发现,脊髓损伤组神经细胞数目明显减少,细胞形态萎缩,组织出现空泡。黄连素组对比脊髓损伤组,神经细胞数目有所提高。5.尼氏染色发现黄连素减少了脊髓空洞面积,提高剩余白质面积百分比。第三部分黄连素诱导Beclin1依赖自噬减少原代脊髓神经细胞中脂多糖诱导炎症反应1.MTT检测发现黄连素明显促进了脂多糖诱导原代神经细胞炎症的细胞存活率。2.TUNEL染色发现黄连素明显抑制了脂多糖诱导的神经细胞凋亡。3.ELISA检测发现黄连素减轻了脂多糖诱导炎症因子TNF-ɑ和IL-1β含量。4.实验发现脂多糖可以促进自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达,黄连素进一步上调了自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达,再沉默Beclin1后,自噬相关蛋白Beclin1和ATG12表达明显降低。第四部分黄连素通过p70s6k/mTOR通路调控脊髓损伤后自噬1.通过Western blot观察p70s6k,p-mTOR蛋白表达情况,发现脂多糖诱导组对比正常对照组p70s6k,p-mTOR蛋白表达降低。2.黄连素组对比脂多糖诱导组进一步减少了p70s6k,p-mTOR蛋白表达。结论:1.本研究发现黄连素可以促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复;黄连素减轻了脊髓损伤水肿程度;黄连素减轻脊髓损伤后炎症因子TNF-α和IL-1β含量和其mRNA表达。2.脊髓损伤后自噬相关蛋白激活,黄连素进一步促进了脊髓损伤后自噬活性;黄连素通过诱导少突胶质细胞Beclin1依赖自噬促进炎症因子清除;黄连素促进了脊髓损伤前角运动神经细胞数量,减少了脊髓损伤组织空洞形成,提高了剩余白质面积百分比。3.黄连素能够减轻脂多糖诱导神经细胞炎症,其抗炎作用能够被3-MA抑制,说明黄连素通过诱导自噬减轻炎症反应,减少神经细胞凋亡。4.黄连素通过抑制p70s6k/mTOR通路激活自噬。黄连素通过诱导Beclin1依赖自噬减轻脊髓损伤炎症及凋亡,促进脊髓损伤神经功能修复。