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背景:宫颈癌是一种常见的妇科肿瘤,且发病率呈逐年升高和年轻化趋势,也是严重危害女性健康的疾病,死亡率居女性恶性肿瘤第2位。目前,药物和妇科手术治疗虽对肿瘤取得一定疗效,但中晚期恶性肿瘤普遍预后不良的局面并未改变。近年来国内外学者虽对宫颈癌的研究不断深入,但宫颈癌的具体发病机制仍未完全明确。因此,在临床上迫切需要进一步探讨宫颈癌的具体发病机制,为改善宫颈癌尤其是晚期及复发性宫颈癌的治疗与预后提供新思路。有研究发现信号转导和转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)是一种重要的调控基因,与宫颈癌的复发、淋巴转移及患者预后等明显相关,对宫颈癌细胞具有重要的调控作用,能够引起细胞自噬调控的异常从而影响肿瘤的进展;同时也有大量的研究表明,自噬与宫颈癌细胞的增殖、分化及转移等有密切联系。目的:1.研究STAT3与宫颈癌HeLa细胞的增殖、凋亡及自噬的关系,为后续研究STAT3介导的细胞自噬在宫颈癌干细胞中是否发挥类似的调控作用打下实验基础。2.应用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究STAT3基因在宫颈癌干细胞自噬发生中的作用以及可能的分子机制。方法:1.研究STAT3与宫颈癌HeLa细胞的增殖、凋亡及自噬的关系1)通过质粒瞬时转染宫颈癌HeLa细胞调节STAT3蛋白表达,构建不同蛋白表达量的STAT3组;2)实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测各组细胞STAT3的mRNA表达水平;3)CCK-8实验、流式细胞仪分别检测不同STAT3蛋白表达组的细胞增殖和凋亡能力;4)通过电镜观察各组细胞的凋亡小体及自噬小体;5)Western blot实验检测STAT3高表达组、对照组及低表达组在宫颈癌HeLa细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3及内噬相关基因Becl inl和LC3-II的蛋白表达情况。2.从宫颈癌Hela、SiHa细胞提取宫颈癌干细胞及鉴定1)利用肿瘤干细胞无血清悬浮培养法分离培养宫颈癌干细胞;2)通过加入20%的血清诱导悬浮宫颈癌干细胞球分化为贴壁细胞;3)流式细胞仪检测细胞表面分子标记物CD133和CD44的表达鉴定宫颈癌干细胞;4)CCK-8实验检测宫颈癌干细胞的增殖能力;5)细胞平板克隆实验检测宫颈癌干细胞的克隆率;6)流式细胞仪检测宫颈癌干细胞的凋亡率。3.STAT3介导的细胞自噬在宫颈癌干细胞的调控作用及其可能机制1)CRISPR/Cas9基因编辑技术构建STAT3突变的单克隆Hela宫颈癌干细胞稳转株;2)自噬荧光(MDC染色)检测宫颈癌干细胞稳转株自噬发生的情况;3)qPCR法检测在各组宫颈癌干细胞稳转株中自噬相关蛋白Beclin1、LC3B、P62及Bcl-2的mRNA表达情况。成果:1.STAT3可促进宫颈癌HeLa细胞增殖,抑制其凋亡及自噬1)成功构建三组不同STAT3蛋白表达量的HeLa宫颈癌细胞组,qRT-PCR验证转染效果满意;2)CCK-8实验、流式细胞仪分别检测不同STAT3蛋白表达组的细胞增殖和凋亡能力,提示STAT3能显著提高宫颈癌HeLa细胞的增殖能力,同时STAT3也能显著抑制宫颈癌HeLa细胞的凋亡;3)电镜观察各组细胞的凋亡小体及自噬小体的结果表明上调STAT3表达可抑制宫颈癌细胞的凋亡及自噬的发生;4)Western blot法检测各组细胞的Bcl-2、Caspase-3、Beclin1和LC3-II蛋白表达的结果表明STAT3促进HeLa细胞增殖可能与降低Caspase-3、Beclin1和LC3-II基因表达相关。2.成功从宫颈癌Hela、SiHa细胞分离及鉴定宫颈癌干细胞1)成功利用肿瘤干细胞无血清悬浮培养法分离培养宫颈癌干细胞;2)通过加入20%的血清诱导悬浮宫颈癌干细胞球分化为贴壁细胞;3)流式细胞仪检测细胞表面分子标记物CD133和CD44的表达鉴定宫颈癌干细胞;4)CCK-8实验检测宫颈癌干细胞的增殖能力的结果表明宫颈癌干细胞具有更高的增殖能力;5)细胞平板克隆实验检测宫颈癌干细胞的克隆率的结果显示,宫颈癌干细胞与亲本细胞相比具有更高的克隆能力;6)流式细胞仪检测宫颈癌干细胞的凋亡率的结果显示,与亲本细胞相比,宫颈癌干细胞的凋亡率下降。3.STAT3介导的细胞自噬在宫颈癌干细胞的调控作用及其可能机制1)成功通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建STAT3突变的单克隆Hela宫颈癌干细胞稳转株共四组,分别为高表达组、高表达对照组、低表达组、低表达对照组;2)自噬荧光(MDC染色)检测宫颈癌干细胞稳转株自噬发生的情况,表明STAT3对宫颈癌干细胞自噬的发生具有重要的调节作用,抑制STAT3的表达能显著地促进宫颈癌干细胞发生自噬;3)qPCR法分别检测在各组宫颈癌干细胞稳转株中Beclin1、LC3B、P62及Bcl-2的mRNA表达的结果表明STAT3促进宫颈癌干细胞的增殖可能与增加Bcl-2蛋白的表达量有关,STAT3抑制宫颈癌干细胞发生细胞自噬可能与降低Beclin1、LC3B而增加P62蛋白的表达有关;同时研究表明STAT3参与宫颈癌干细胞的自噬调控作用,并推测其自噬调控的分子机制可能通过STAT3/Bcl-2/Beclin1轴发生作用。结论:1.STAT3介导了宫颈癌HeLa细胞的发生发展,将STAT3作为靶点为逆转宫颈癌HeLa细胞提供了一个全新的途径。2.利用肿瘤干细胞无血清悬浮培养法可以从Hela细胞系中分离富集到具有稳定宫颈癌干细胞性质的细胞群。3.STAT3可能是宫颈癌干细胞自噬激活的一个靶基因。4.在STAT3介导的宫颈癌干细胞自噬的发生发展中,STAT3/Bcl-2/Beclin1轴参与并发挥了一定的作用。