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目的:树突状细胞是体内功能最强的抗原提呈细胞,能够捕获、加工、提呈抗原,启动免疫应答,在免疫抗肿瘤方面发挥举足轻重的作用。但是由于树突状细胞(Dendritic cells,DCs制备过程长、生存期短,体外难以模拟其生理成熟等因素,制约了DC瘤苗的发展。本实验拟构建携带CCL21-linker-exCD40L融合基因的真核表达载体,通过融合基因在体内肿瘤组织局部表达,趋化并活化DCs,发挥抗肿瘤作用。方法:首先,在GeneBank检索小鼠CCL21及CD40L基因编码序列,确定扩增区域,设计引物。以Trizol抽提小鼠脾脏总RNA,通过RT-PCR方法获得CCL21及exCD40L基因。重叠PCR方法将CCL21分泌型信号肽(CCL21sig)与exCD40L连接,获得CCL21sig-exCD40L基因,使得CD40L能够以分泌形式表达,与CCL21基因分别作为融合基因的对照。重叠PCR构建CCL21-linker-exCD40L融合基因,将其克隆入T载体进行测序,将测序正确的融合基因片段连接到真核表达载体pcDNA3.1。将pcDNA3.1/CCL21-linker-exCD40L质粒转染CHO细胞,Western Blot法检测融合基因蛋白在细胞膜上的表达。通过趋化实验对融合基因进行活性检测。构建小鼠结肠癌肿瘤模型,体外转染CCL21-linker-exCD40L真核表达载体,验证其抗肿瘤作用。结果:通过RT-PCR方法扩增约420bp大小的产物CCL21及约650bp大小的产物exCD40L,二者均与预期目的片段大小一致,通过重叠PCR方法顺序连接CCL21与exCD40L、CCL21sig与exCD40L,分别得到产物大小约1100bp及720bp,与预期目的片段大小一致,将CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L进一步连接入T载体,经测序验证,序列正确。以上构建的3个重组T载体酶切后将目的片段与pcDNA3.1真核表达载体片段连接,构建真核表达载体pcDNA3.1/CCL21-linker-exCD40L及对照组载体pcDNA3.1/CCL21、pcDNA3.1/CCL21sig-exCD40L,酶切验证,分别得到与目的基因及pcDNA3.1载体片段(约5400bp)。Western blot法进一步验证次结果,分子量分别约为43KD,14KD及30KD,与目的蛋白大小一致。通过Millicell小室法验证融合蛋白对树突装细胞具有较强趋化功能,其每高倍镜视野穿膜细胞数是空载体对照组的14.95倍。用小鼠结肠癌细胞系C26成功构建小鼠肿瘤模型,肿瘤原位注射融合基因后,融合基因发挥抗肿瘤作用。结论:成功构建分别携带CCL21-linker-exCD40L、CCL21、CCL21sig-exCD40L基因的真核表达载体,将其转染真核细胞后均能够正常表达。体外实验证实转染融合基因的细胞载体对DCs具有趋化活性。瘤内注射小鼠后,融合基因发挥的抗肿瘤作用,且抗肿瘤作用较CCL21及CCL21sig-exCD40L强。