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目的:构建家蝇u93基因原核表达体系,并对重组表达产物活性进行初步鉴定。制备特异性的u93基因编码蛋白的多克隆抗体,初步验证家蝇u93蛋白时空表达特征。方法:采用生物信息学方法,分析u93基因序列及其编码蛋白;将前期构建的pET29a-u93重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞中,以IPTG诱导表达重组蛋白并通过SDS-PAGE对表达产物进行分析;以Ni-NTA法纯化重组蛋白,采用微量液体稀释法和MTT比色法检测u93重组蛋白的体外抗菌活性。采用蛋白免疫法,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体;用ELISA法检测多克隆抗体效价;运用Western-Blotting方法对多克隆抗体的纯度和特异性进行分析。解剖正常饲养家蝇三日龄幼虫不同组织(唾液腺、血淋巴、脂肪体、肠道、气管、马氏管和体壁),Western-Blotting检测家蝇u93蛋白组织定位;显微超微量注射仪注射白色念珠菌感染家蝇三日龄幼虫,Western-Blotting方法检测家蝇u93蛋白在3h、6h、9h、12h、和24h的肠道表达情况。结果:生物信息学分析显示,u93编码基因ORF全长363bp,共编码120个氨基酸,理论分子量为13.35KDa,等电点为7.52,信号肽位于1-20位氨基酸之间,是胞内分泌性蛋白,属于SVWC(Single domain von Willebrand factor type C)超家族。u93重组蛋白在大肠杆菌BL21/DE3中主要以包涵体形式表达,重组蛋白的相对分子质量与理论值相一致;u93重组蛋白对白色念珠菌的MIC为21μg/mL、对近平滑念珠菌MIC为12.5μg/mL、对克柔念珠菌MIC为12.5μg/mL、对热带念珠菌MIC为12.5μg/mL,但不能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖。制备的兔抗u93重组蛋白多克隆抗体效价为1:4000;Western-Blotting结果显示,该多克隆抗体能特异性识别天然u93蛋白。正常饲养的家蝇三日龄幼虫,解剖其不同组织(唾液腺、血淋巴、脂肪体、肠道、气管、马氏管和体壁),Western-Blotting结果表明,家蝇u93蛋白组织定位在肠道。白色念珠菌感染后,感染6h时,家蝇u93蛋白表达量显著升高,随着时间的延长,感染12h时,家蝇u93蛋白表达量显著降低。感染组和对照组比较,均呈现先升高后降低再升高的趋势。结论:成功克隆了家蝇u93基因并构建了PET-29a-u93原核表达体系并获得纯化蛋白及免疫血清。微量液体稀释法和MTT比色法证实了家蝇u93重组蛋白抗真菌活性。Western-Blotting结果表明,制备的多克隆抗体纯度和特异性较好,家蝇u93蛋白主要定位在肠道,具有组织特异性。家蝇三日龄幼虫感染白色念珠菌,感染6h后,家蝇u93蛋白表达量显著升高。尤其在感染12h后,家蝇u93蛋白表达量显著降低,推测其参与了肠道先天免疫过程,抵御病原微生物的入侵,蛋白质可能发生了损耗,从而使蛋白表达量降低;也可能白色念珠菌分泌一些蛋白酶,降解家蝇u93蛋白,导致蛋白表达量降低。为后续研究家蝇先天性免疫系统对真菌识别机制奠定了基础。