酶是高效、高选择性、环境友好的生物催化剂,在化工、医药、能源、食品、环保等领域发挥着日益重要的作用,工业生产对酶的种类和性能的要求也越来越多样化。利用宏基因组技术从天然环境中挖掘新酶基因,以及利用分子定向进化技术对现有酶制剂进行分子改造,是获得性质优良的新酶源的主要途径。高通量筛选方法可以对大容量基因文库进行高效筛选,是从酶突变库及环境宏基因组库中获得极少数所需个体的核心关键技术,因此受到国际学术界的广泛关注。基于单细胞微反应器的酶超高通量筛选体系是近年来新兴的技术体系,它在皮升级的微液滴中进行单细胞酶反应,并通过流式细胞仪或微流控芯片进行分析和筛选,其筛选通量可高达10~8/天。而且,由于微反应器的体积比常规微孔板体系减少了百万倍以上,从而大大降低了筛选的试剂成本。然而,基于单细胞微反应器的酶筛选技术目前仍存在一系列问题,表现为:(1)基于微液滴的微反应器均一度较差,从而影响酶活性定量及筛选效率;(2)用于微反应器检测和分选的流式细胞仪价格昂贵,限制了该体系的广泛应用;(3)由于筛选底物种类较少,可用微反应器筛选体系进行筛选的酶种类有限。为解决上述问题,本论文开展了以下工作:(1)高均一度的单细胞“水-油-水”微反应器制备:针对常规匀浆法制备微反应器均一度差的缺点,本论文利用膜挤出仪开发了新的“水-油-水”微液滴制备方法,生成的微液滴均一度显著提高,从而极大地提高了酶活性定量的准确度,能够有效区分酶活性差别在2倍以内的样品。本论文利用该体系,成功实现了嗜热酯酶AFEST的定向进化:通过对容量达200万的随机突变库进行仅一轮筛选,便获得了酶活性提高了两倍的阳性突变体,其催化效率接近分子扩散效率的极限。突变体保持了野生型酶优良的热稳定性及拓宽的底物谱,对药物中间体7-氨基头孢烷酸的水解活性也提高3倍,体现了该酶在头孢类抗生素的酶法合成中的工业应用潜力。(2)基于微流控芯片的“水-油”微反应器双色荧光分选:微流控芯片具有成本低、体系灵活等优点,能够在极小的体积上整合液滴生成、操纵、分析等整套功能,为酶高通量筛选带来了新的契机。本论文开发了基于微流控芯片的“水-油”微反应器双色荧光检测分选体系,可同时考察两种荧光信号变化,筛选通量高达1400/秒,在酶的底物特异性、立体选择性、区位选择性等功能的筛选中具有重要应用潜力。应用该体系,本论文成功对酯酶AFEST的立体选择性进行了定向进化,获得了对重要抗炎药物S型异丙基布洛芬活性和立体选择性都显著提高的阳性突变体。(3)“荧光微液滴捕获”底物设计策略:为了提高微反应器筛选体系在不同酶系中的应用潜力,本论文提出了“荧光微液滴捕获(fluorescence droplet entrapment,FDE)”这一底物设计策略,并在磷酸三酯酶、羧酸酯酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶等微反应器体系中进行了验证。FDE通过控制分子疏水性的变化,能够严格地控制液滴内酶反应起始时间、降低荧光背景干扰、极大地提高筛选体系准确度与灵敏度。本论文还对FDE在其它重要酶系统中的应用进行了展望,以期扩展单细胞微反应器筛选体系的通用性。