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目的建立一个特异、快速、高效的蛋白酶信号放大系统,为临床分子生物学检测提供新一代分子诊断技术。主要建立蛋白酶信号放大HRV3C系统及蛋白酶信号放大TEV系统。方法通过倒置蛋白酶N端、C端结构域,截去或插入部分蛋白序列,构建FRB-Protease-N-FPRl-Protease-C四聚体,N、C片段重组等干扰蛋白酶活性中心的策略,构建含有活性蛋白酶识别位点的可自我激活的蛋白酶原,将编码重组酶原的DNA序列克隆到pET24a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni柱亲和层析纯化获得重组蛋白酶原,再通过蛋白酶实验筛选可应用于蛋白酶信号放大系统的蛋白酶原。结果1)蛋白酶信号放大HRV3C系统共构建了4个系列的酶原,HRV3C-Rev系列共构建了11个重组蛋白酶原,HRV3C活性位点系列构建了3个重组蛋白酶原,HRV3C中间连接环剪切插入系列构建了5个重组蛋白酶原,及FRB-HRV N-FPR-HRV C系列构建了1个重组蛋白酶原。]HRV3C-Rev-79,80,HRV3C-43,44及HRV3C-66,67在蛋白纯化过程中自我激活。纯化得到的HRV3C-Rev-106,107可随时间延长发生自我激活。HRV3C-tetra在不加入raprmycin长时间诱导的情况下就发生自我激活。其余重组蛋白酶原呈HRV3C蛋白酶浓度依赖性。2)蛋白酶信号放大TEV系统构建了3个系列的蛋白酶原,TEV-Rev及剪切系列构建了21个重组蛋白酶原,FRB-TEV N-FPR-TEV C系列构建了1个重组蛋白酶原,及TEVN、C片段重组系列构建了2个酶原。除TEV-Rev14-222重组蛋白酶原外,TEV-Rev及剪切系列其余蛋白酶原在短时间诱导后出现自我激活。纯化得到的TEV-Rev14-222酶原切割呈TEV蛋白酶浓度依赖性。TEV-tetra在不加入aparmycin短时间诱导的情况下就发生自我激活。混合TEV-N及TEV-C片段就可发生自我激活,不呈TEV蛋白酶浓度依赖性,TEV-N片段具有酶切活性。结论本课题构建的重组蛋白酶原不能满足蛋白酶信号放大系统的要求,但我们从中发现了具有潜在应用价值的重组蛋白酶原。