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背景目前,心血管疾病是全世界的主要死亡原因,我国患有心血管疾病的患者也在不断增长。研究表明,几乎所有形式的心脏疾病都与病理性心肌纤维化有关。据报道,心衰患者的住院率和死亡率与心肌纤维化的程度密切相关,提示心力衰竭最终的病理过程是心肌纤维化。因此,防治心肌纤维化对心力衰竭的治疗至关重要。lnc RNAs（长链非编码RNA）是长度＞200 nt的不编码蛋白质的RNA分子,主要分布在胞核或胞质内,它们通过转录前后调控基因的表达,在许多疾病的发生发展过程中扮演重要的角色。在小鼠和人类心脏中的测序研究结果显示,有些lnc RNAs在心肌纤维化病理模型中差异表达,提示可能参与心肌纤维化的调节过程,为逆转心肌纤维化提供重要靶点。最近有报道表明,lnc RNA 554在心肌纤维化模型中表达上调,生物信息学分析发现lnc RNA 554与已知参与ECM受体相互作用的六种基因呈正相关。此外,有研究表明,lnc RNA 554在小鼠肺纤维化模型和肺成纤维细胞纤维化模型中表达上调,lnc RNA 554可通过抑制mi R-26a促进成纤维细胞分泌细胞外基质,并进一步证实Smad2可在转录水平上抑制mi R-26a的表达,lnc RNA 554通过调节mi R-26a/Smad2相互抑制介导其促纤维化作用。因此,以上研究都提示lnc RNA554可能是心肌纤维化中的重要调节因子,然而lnc RNA 554在心肌纤维化中的作用及具体分子机制尚未报道。目的本研究将通过体内和体外实验探索lnc RNA 554在小鼠心梗后心肌纤维化中的作用及机制,为改善心肌纤维化寻找新的治疗靶点。方法1.对6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠进行尾静脉注射敲低lnc RNA 554腺相关病毒（AAV9-sh-Lnc554）,4周后制作心脏冰冻切片,在荧光显微镜下观察心脏组织GFP荧光强度,q RT-PCR检测感染后心肌组织中lnc RNA 554水平;2.尾静脉注射敲低lnc RNA 554腺相关病毒4周后行心梗手术,2周后,利用小动物心脏超声测量小鼠心脏功能变化情况,部分心脏用于HE和Masson染色以观察纤维化程度,此外WB观察TSP-1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、Col 1蛋白水平,q RT-PCR检测各组α-SMA、Col 1、mi R-543的水平的表达水平;3.从1-3天的C57/BL6乳鼠心脏中分离提取原代成纤维细胞（CFs）,用IF检测波形蛋白（Vimentin）鉴定心脏成纤维细胞。设计3条lnc RNA 554小干扰RNA,以及转染CFs 24h和48h,q RT-PCR检测lnc RNA 554的水平以筛选出最佳的沉默方案;4.si-Lnc 554转染CFs,用q RT-PCR、WB及细胞免疫荧光技术检测细胞中的α-SMA和Col 1的表达水平。q RT-PCR检测mi R-543-3p的表达水平;5.构建过表达lnc RNA 554的慢病毒载体,使用MOI=100的慢病毒滴度感染CFs72h后,倒置荧光显微镜观察细胞的GFP荧光情况,q RT-PCR检测lnc RNA554的表达情况。q RT-PCR、WB及IF检测α-SMA和Col 1的表达水平;6.生信预测lnc RNA 554与mi R-543-3p的结合位点,针对结合位点,委托公司构建lnc RNA 554的野生型（WT）和突变型（MUT）双荧光素酶质粒,与mi R-543-3p mimics共转染293T细胞48h,利用Dual-Glo?双萤光素酶检测系统检测荧光素酶活性;7.订购mi R-543-3p mimics（50n M）及mi R-543-3p inhibitor（100n M）,转染CFs48h后,q RT-PCR检测mi R-543-3p表达水平以验证过表达效果;并且q RTPCR和WB检测α-SMA和Col 1的表达水平;8.6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠,行心梗手术后第7、9、11、13天尾静脉注射agomir-543（20nmol/次/只）,第14天行心脏超声测量小鼠心脏功能变化情况。部分心脏用于病理染色以观察纤维化程度,此外WB观察TSP-1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、Col 1的蛋白水平,q RT-PCR检测mi R-543水平;9.利用si-Lnc 554和mi R-543-3p inhibitor共转染CFs,WB检测α-SMA、Col 1的蛋白表达水平;10.Targetscan数据库预测mi R-543-3p与TSP-1的结合位点,针对结合位点,委托公司构建TSP-1 3’UTR野生型（WT）和突变型（MUT）双荧光素酶质粒,与mi R-543-3p mimics共CFs 48h,利用Dual-Glo?双萤光素酶检测系统检测荧光素酶活性;11.mi R-543-3p mimics及mi R-543-3p inhibitor分别转染CFs 48h后,WB检测TSP-1、TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白水平;12.以0mM、1mM、5mM、10mM、20mM、50mM浓度梯度的TSP-1抑制剂（LSKL）处理细胞,WB检测TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA、Col 1的蛋白表达水平,以筛选出合适的LSKL浓度;13.利用mi R-543-3p inhibitor及LSKL处理CFs,WB检测TSP-1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA和Col 1的蛋白水平;14.利用si-Lnc 554处理细胞,q RT-PCR和WB检测TSP-1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3的表达水平;此外利用si-Lnc 554和mi R-543-3p inhibitor共转染CFs,WB检测以上指标的蛋白水平。结果1.小鼠MI后14天超声心动图结果显示,敲低lnc RNA 554能明显改善EF、FS、LVIDd及LVIDs。心脏组织HE及Masson染色结果显示,敲低lnc RNA 554能明显改善梗死面积和纤维化程度。此外,敲低lnc RNA 554后心脏梗边区组织的Col 1、α-SMA及TSP-1、TGF-β1、p-Smad3/smad 3的表达皆明显下降,而梗边区的mi R-543表达明显升高。2.心脏成纤维细胞转染si RNA 1-3后,si RNA-2沉默效率最高,而且处理48h的沉默效率高于24h的沉默效率。所以选择si RNA-2（50 n M,48h）作为后续试验的转染方案;相比于对照组,si-Lnc 554组的α-SMA和Col 1的表达水平均降低;3.当慢病毒MOI=10和50时荧光强度较弱,表示感染阳性率低;当MOI=100时,GFP荧光表达强,表示感染阳性率高,同时q RT-PCR结果显示lnc RNA554表达显著升高;慢病毒载体成功过表达lnc RNA 554后,LV-Lnc 554组的α-SMA和Col 1的m RNA和蛋白水平显著高于空病毒组;4.si-Lnc 554转染心脏成纤维细胞后,发现si-Lnc 554组的mi R-543-3p的水平显著升高;5.lnc RNA 554与mi R-543-3p的双荧光素酶试验结果表明,mi R-543模拟物抑制了lnc RNA 554野生型荧光素酶的活性,但对突变型没有抑制作用,表明lnc RNA 554与mi R-543-3p具有直接结合位点;6.mi R-543-3p mimics转染CFs 48h后,q RT-PCR结果显示mi R-543 mimics组的mi R-543-3p表达水平显著高于对照组。此外,q RT-PCR和WB均显示过表达mi R-543-3p后α-SMA、Col 1的m RNA和蛋白表达水平显著降低;7.mi R-543-3p inhibitor转染CFs 48h后,发现抑制mi R-543-3p后α-SMA、Col1的m RNA和蛋白表达水平显著升高;8.小鼠心肌梗死后14天超声心动图结果显示,MI+agomir-543组的EF、FS、LVIDd及LVIDs明显改善。心脏组织HE及Masson染色结果显示,过表达mi R-543能明显改善梗死面积和纤维化程度。此外,过表达mi R-543组的心脏梗边区组织的Col 1、α-SMA、TSP-1、TGF-β1、p-Smad3/Smad3的表达皆明显下降;9.过表达mi R-543-3p后TSP-1、TGF-β1、p-Smad3/Smad3的蛋白表达水平显著降低;而相比于对照组,抑制mi R-543-3p后以上指标均显著上调;10.mi R-543-3p与TSP-1的双荧光素酶试验结果表明,mi R-543模拟物可抑制TSP-1-WT的荧光素酶活性,但对TSP-1-MUT没有影响,表明TSP-1是mi R-543-3p的靶标;11.当LSKL浓度为10mM时,q RT-PCR及WB发现TGF-β1、p-Smad3/Smad3、α-SMA、Col 1的蛋白表达水平明显下降;12.相比mi R-543-inhibitor组,mi R-543-inhibitor+LSKL组的TGF-β1、pSmad3/Smad3、α-SMA、Col 1的蛋白表达水平明显升高;13.相比于对照组,si-Lnc 554组的TSP-1、TGF-β1、p-Smad3/Smad3的蛋白表达水平显著降低;14.si-Lnc 554和mi R-543-3p inhibitor共转染CFs,与si-Lnc 554+mi R-543 NC组相比,si-Lnc 554+mi R-543-inhibitor组的α-SMA、Col 1、TSP-1、TGF-β1、pSmad3/Smad3蛋白水平显著升高。结论敲低lnc RNA 554可改善小鼠心肌梗死后心肌纤维化及心功能,其机制可能是lnc RNA 554通过调控mi R-543/TSP-1/TGF-β1/Smad 3信号通路影响心肌纤维化的过程。