论文部分内容阅读
第一部分中枢JAZF1对外周糖代谢的影响及其作用机制 第一节中枢JAZF1在胰岛素抵抗模型鼠中的表达 目的:探索中枢JAZF1在胰岛素抵抗模型鼠中的表达变化,初步了解中枢JAZF1与胰岛素抵抗的关系。 方法:将8周龄的SD大鼠随机分为普食喂养组和高脂喂养组;同样的将C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠分别随机分为普食喂养组和高脂喂养组,各组分别普食和高脂喂养12周;同时普食喂养db/db鼠20周。采用Western Blot技术分别检测SD大鼠、C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠以及db/db鼠下丘脑中JAZF1的相对蛋白水平表达。 结果:与普食喂养组相比,在高脂喂养的 SD大鼠中、C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠中,下丘脑JAZF1蛋白水平显著降低(P<0.01);并且,糖尿病模型鼠db/db鼠下丘脑的JAZF1蛋白水平也明显降低(P<0.01)。 结论:中枢JAZF1与胰岛素抵抗的发生发展具有密切相关性。 第二节中枢JAZF1表达上调对肝脏糖异生及体内外胰岛素信号通路的影响 目的:探索中枢JAZF1对肝脏糖异生、中枢及外周经典胰岛素信号通路的影响。 方法:将健康雄性SD大鼠随机分为两大组:普食喂养组(NCD)和高脂喂养组(HFD)。各组小鼠分别普食和高脂喂养10周后,又将各组分别随机分为三个亚组:生理脑脊液组(aCSF)、空载腺病毒组(Ad-GFP)和 JAZF1过表达腺病毒组(Ad-JAZF1)。利用定量 PCR技术检测肝脏糖异生关键基因 PEPCK和 G6Pase的 mRNA水平;Western Blot技术检测肝脏糖异生关键基因PEPCK和G6Pase的蛋白水平变化、肝脏及下丘脑中经典胰岛素信号通路指标磷酸化水平的变化;免疫荧光染色技术检测下丘脑PIP3的表达变化。体外实验:常规培养神经元模型细胞人神经母细胞瘤细胞sh-SY5Y细胞,用胰岛素抵抗诱导剂Glucosamine构建神经元胰岛素抵抗模型,再转入Ad-JAZF1过表达质粒,检测模型细胞中胰岛素信号通路指标 p-InsR/t-InsR及p-AKT/t-AKT磷酸化水平的变化。 结果:普食喂养组中,三个亚组糖代谢水平无显著差异(P>0.05);而在高脂喂养组中,与aCSF组和Ad-GFP组相比,Ad-JAZF1组PEPCK和G6Pase的mRNA水平以及相对蛋白水平均显著降低(P<0.01),而经典胰岛素信号通路指标的磷酸化水平均明显增高(P<0.01)。体外实验中,胰岛素刺激下,非胰岛素抵抗组Ad-GFP组与Ad-JAZF1组的胰岛素信号通路指标无显著差异(P>0.05),而在胰岛素抵抗组中, Ad-JAZF1组的胰岛素信号通路指标磷酸化水平明显增加(P<0.01)。 结论:中枢JAZF1基因表达上调,可以抑制肝脏糖异生水平,激活肝脏及中枢的经典胰岛素信号通路,改善机体的胰岛素抵抗状态。 第三节中枢JAZF1影响外周糖代谢的信号通路及其作用机制 目的:验证中枢JAZF1改善肝脏糖代谢的信号通路。 方法:筛选中枢JAZF1影响肝脏糖异生的信号通路,将健康雄性大鼠分为2大组,分别为:肝迷走神经离断组,K离子通道阻断组。两组组均用高脂喂养,并分别分为四个亚组。肝迷走神经离断组分为:假手术组(SHAM)+Ad-GFP,SHAM+Ad-JAZF1,肝迷走神经离断组(HVG)+Ad-GFP,HVG+Ad-JAZF1;K离子通道阻断组分为:Ad-GFP组,Ad-JAZF1组,格列本脲(GLI)+ Ad-GFP组,GLI+Ad-JAZF1组。建立下丘脑 MBH区域靶向给药系统,行选择性肝迷走神经离断术,利用定量PCR和Western Blot技术分别检测肝脏糖异生关键基因PEPCK和G6Pase的mRNA及蛋白相对水平表达变化。体外实验:分离及培养下丘脑神经元原代细胞,利用PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K信号通路,检测JAZF1过表达对下游K离子通道亚基蛋白(SUR1,Kir6.2)的影响。 结果:肝迷走神经离断组:肝迷走神经离断手术后,中枢 JAZF1对肝脏PEPCK和G6Pase的降低作用明显减弱(P<0.05);K离子通达阻断组:K离子通达阻断剂格列苯脲可以抑制中枢JAZF1降低肝脏PEPCK和G6Pase的作用(P<0.05)。体外实验:成功分离及培养下丘脑神经元原代细胞,JAZF1通过 PI3K途径调控 K离子通道蛋白亚基SUR1和Kir6.2。 结论:中枢JAZF1主要通过PI3K途径调控K离子通道,经肝迷走神经向外周传递信号,从而对外周糖代谢产生影响。 第二部分中枢Sfrp5对外周糖代谢的影响及其作用的信号通路 第一节中枢Sfrp5在胰岛素抵抗模型鼠中的表达 目的:探索中枢Sfrp5在胰岛素抵抗模型鼠中的表达变化,初步了解中枢Sfrp5与胰岛素抵抗的关系。 方法:将8周龄的C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠分别随机分为普食喂养组和高脂喂养组,各组分别普食和高脂喂养12周;同时普食喂养db/db鼠20周。采用Western Blot技术分别检测C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠以及db/db鼠下丘脑中Sfrp5的相对蛋白水平表达。 结果:与野生小鼠相比,糖尿病模型鼠db/db鼠下丘脑的Sfrp5蛋白水平明显降低(P<0.01)。与普食喂养组相比,高脂喂养的C57BL/6J小鼠、脂联素敲除小鼠下丘脑中的Sfrp5蛋白水平均显著降低(P<0.01);并且,在普食喂养组和高脂喂养组组内,脂联素敲除小鼠下丘脑Sfrp5蛋白较野生小鼠水平均显著降低(P<0.01)。 结论:中枢Sfrp5与胰岛素抵抗的发生发展具有密切相关性。 第二节中枢Sfrp5表达上调对肝脏糖异生及体内外胰岛素信号通路的影响 目的:探索中枢Sfrp5对肝脏糖异生、中枢及外周经典胰岛素信号通路的影响。 方法:将健康雄性SD大鼠随机分为两大组:普食喂养组(NCD)和高脂喂养组(HFD)。各组小鼠分别普食和高脂喂养10周后,又将各组分别随机分为两个亚组:生理脑脊液组(aCSF)和 Sfrp5重组蛋白输注组(Sfrp5)。利用定量PCR技术检测肝脏糖异生关键基因PEPCK和G6Pase的mRNA水平;Western Blot技术检测肝脏糖异生关键基因PEPCK和 G6Pase的蛋白水平变化、肝脏及下丘脑中经典胰岛素信号通路指标磷酸化水平的变化;免疫荧光染色技术检测下丘脑PIP3的表达变化。体外实验:常规培养神经元模型细胞人神经母细胞瘤细胞sh-SY5Y细胞,用胰岛素抵抗诱导剂Glucosamine构建神经元胰岛素抵抗模型,再加入Sfrp5重组蛋白,检测模型细胞中胰岛素信号通路指标p-InsR/t-Ins及p-AKT/t-AKT磷酸化水平的变化。 结果:普食喂养组中,两个亚组糖代谢水平无显著差异(P>0.05);而在高脂喂养组中,与aCSF组相比, Sfrp5组PEPCK和G6Pase的mRNA水平以及相对蛋白水平均显著降低(P<0.01),而经典胰岛素信号通路指标的磷酸化水平均明显增高(P<0.01)。体外实验中,胰岛素刺激下,非胰岛素抵抗组对照组与Sfrp5组的胰岛素信号通路指标无显著差异(P>0.05),而在胰岛素抵抗组中,Sfrp5组的胰岛素信号通路指标磷酸化水平较对照组明显增加(P<0.01)。 结论:中枢Sfrp5基因表达上调,可以抑制肝脏糖异生水平,激活肝脏及中枢的经典胰岛素信号通路,改善机体胰岛素抵抗状态。