焦虑症是复杂的应激相关的功能紊乱,它包括广泛性焦虑、社交恐惧、创伤后应激综合症、强迫症等。其中,广泛性焦虑的终身发病率达到了 4.1%-6.6%。广泛性焦虑是一种常见的精神紊乱。然而,关于其发病机理还有待于进一步探索。在过去的50年里,焦虑症主要是用苯二氮卓类药物治疗。尽管这些药物一般耐受性良好,但长期使用存在药物依赖的风险和不必要的镇静效应。由于这些原因,当前临床实践指南建议使用抗抑郁药,特别是选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)或5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂,作为治疗焦虑症的首选一线药物。苯二氮卓类药物现在作为二线治疗或在SSRIs完全发挥作用的前4-6周作为辅助药物。对于非药物治疗焦虑症,认知行为疗法被认为效果较好。根据动物学和影像学研究,以往的研究提出了关于焦虑恐惧情绪的基本神经元环路。海马和学习记忆以及信息处理相关。海马的紊乱可能导致对潜在威胁信息的过高估计,从而导致病理性焦虑。动物实验也发现腹侧额叶的损伤会影响恐惧消退的正常获得。因此,腹侧额叶的紊乱也可能导致一些病理性焦虑。杏仁核被认为是调控警觉和恐惧反应的关键结构。杏仁核亚区中研究最多的是基底外侧杏仁核(BLA)和杏仁中央核(CeA)。文献中恐惧条件反射相关的结果显示BLA整合关于环境的高度处理过的信息和编码相关的行为。事实上,BLA的有些细胞对威胁的环境信息起反应,有些细胞对不再危险的环境信息起反应。BLA大量投射到杏仁中央核,是其主要的兴奋性输入。杏仁中央核是由中央外侧和中央内侧两部分组成。中央外侧杏仁核抑制中央内侧核,中央内侧核是主要的杏仁核的输出。杏仁中央核在有威胁刺激产生的即刻行为中发挥重要作用,研究表明杏仁中央核失活会降低由声音引起的恐惧反应。这种效应可能是由中央核到下丘脑和脑干的投射引起的,它们调节各种焦虑状态的特性。不同脑区的相互作用影响焦虑状态。研究表明,在腹侧海马(vHPC)注射缝隙连接阻断剂降低vHPC-mPFC的同步性并减少在高架十字迷宫和旷场实验中动物的焦虑水平。BLA-vHPC通路的作用也已通过干扰性的方法进行了研究。据报道,在高架十字迷宫和旷场实验中光控激活BLA-vHPC投射增加焦虑水平,而抑制这个投射纤维可以抗焦虑。正如BLA一样,终纹床核(BNST)在焦虑网络中也有重要的作用。在高架十字迷宫和旷场实验中,光控激活adBNST到外侧下丘脑的投射可以抗焦虑,而激活adBNST到臂旁核的投射选择性降低呼吸节率(焦虑的生理性标志),而不是行为。最后,光控激活adBNST到中脑腹侧被盖区(VTA)的投射选择性地诱导条件位置偏好,小鼠花更多的时间在当adBNT-VTA投射纤维被激活的隔间。神经系统中和焦虑相关的递质系统主要有去甲肾上腺素能途径、多巴胺途径、GABA及5-羟色胺途径。去甲肾上腺素能系统特别在蓝斑起作用,可以提高对危险的警惕。皮层的多巴胺能系统与情感行为和情感的表达有关。GABA是主要的抑制性神经递质。在背侧中缝核的5-HT能系统能抑制和焦虑相关的行为。中枢5-HT的活动具有重要的保持警觉和控制焦虑的作用。这些递质可以相互作用,从而导致焦虑相关的临床表现。本研究主要侧重于5-羟色胺能系统,我们相信此系统在广泛性焦虑的发病中扮演着重要的角色。5-羟色胺被认为可以调控发育和成年的神经元可塑性,从而提高神经网络的灵活性和适应能力,以应对环境挑战,并在杏仁核中参与对刺激信息的处理和应激敏感性的调节。药理调控5-羟色胺的传递发现杏仁核活动模式的改变,及5-羟色胺途径相关信号分子的基因突变导致精神疾病的发病风险增加,这些结果表明了杏仁核中5-羟色胺传递的重要作用。在流经杏仁核环路的神经递质系统调制信息中,特别是5-羟色胺的传递正在受到关注。药理行为研究表明,5-羟色胺系统和焦虑样行为、条件恐惧和压力反应的调节强烈相关,也参与奖励相关行为的调节。从啮齿动物到灵长类动物的所有物种中,杏仁核接受密集的5-羟色胺能支配,实验性调控杏仁核中5-羟色胺能传递导致焦虑样行为的改变。应激与杏仁核中不同的5-羟色胺能传递水平相关,药理调控杏仁核5-羟色胺信号转导可以调控应激诱导的焦虑样行为。在健康志愿者中药理调控5-羟色胺系统发现杏仁核活动的变化,这个功能成像研究表明杏仁核5-羟色胺传递对情绪的调控也存在于人类自身。背侧中缝核是5-羟色胺能神经元富集的脑区。尽管背侧中缝核是包含异质性递质神经元类型的脑区,大部分研究还是侧重于改变背侧中缝核的5-羟色胺水平对行为学的影响。此脑区可以投射到调节焦虑的一些关键脑区,并且在一些应激和焦虑相关刺激后可以激活此脑区的5-羟色胺能神经元。示踪研究表明,大鼠杏仁核5-羟色胺传入纤维主要来自背侧中缝核(DRN),而仅有少量的传入来自内侧中缝核(MRN)。小鼠和灵长类杏仁核具有较高的背侧中缝核投射,因此,大鼠中5-羟色胺能传递调控的研究结果不能用来解释小鼠上面的发现,使用小鼠的研究能更好的作为模拟人类应激和焦虑相关紊乱的模型。相较于其他大脑区域,所有5-羟色胺受体在啮齿动物和灵长类动物的杏仁核,包括人类,都有相对较高的表达。这些受体在不同神经元类型上的表达被用来解释不同5-羟色胺受体激动剂或拮抗剂注射到杏仁核后所产生的效应。但是这些结果可能存在争议。例如,虽然有些研究认为杏仁中央核中应激诱导的5-羟色胺的增加可以诱导对应激和恐惧所产生的内分泌、自助运动和行为反应,其刺激效应可能通过抑制性的5-HT1A受体介导,然而其他人发现5-HT1A受体激动剂注射到CeA可以减少条件性恐惧反应,并且CeA中慢病毒介导的这种受体的下调会产生焦虑。类似的明显不一致的结果是在BLA中5-HT1A介导行为的影响。选择性5-HT1A受体激动剂注射到BLA损害条件性恐惧的获得和表达,然而在社交试验中激活5-HT1A受体似乎是无效的或增强焦虑样行为。根据上述资料,我们认为背侧中缝核是参与焦虑调节的重要核团,背侧中缝核是5-羟色胺能神经元聚集的区域。5-羟色胺系统的重要性及杏仁核中关于5-羟色胺能系统结果的不一致,让我们想到采用光控遗传学方法特异性的干扰背侧中缝核到杏仁核亚区的投射,最终会产生什么样的效应呢。为了探索背侧中缝核对杏仁核的投射及其在焦虑当中的作用,我们对C57 BL/6J小鼠的DRN脑区注射携带广谱启动子CAG的ChR2病毒,ChR2下游插入增强型的绿色荧光蛋白,发现在病毒所携带荧光蛋白在背侧中缝核高表达,而且也发现荧光在杏仁核的表达,主要在BLA和CeA区域。小鼠离体脑片证明了背侧中缝核中ChR2的成功表达,光刺激可以记录到光控诱导电流和动作电位。行为学检测我们主要通过高架十字迷宫和旷场实验来检测小鼠的行为学效应。如果小鼠表现焦虑样行为,那么它们在高架十字迷宫的开臂或旷场试验的中央区域所待的时间减少;如果小鼠表现抗焦虑样行为,那么它们在开臂或中央区域所待的时间增加。实验结果显示,刺激背侧中缝核到CeA的投射纤维可以增加高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间,同时增加旷场实验中在中央区域所待的时间,而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的刺激背侧中缝核到CeA的投射纤维可以降低焦虑水平,发挥抗焦虑样的效应。同样地,刺激背侧中缝核到BLA的投射纤维对高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间没有影响,同时小鼠在旷场实验中中央区域所待的时间也没有显著性差异,而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的刺激背侧中缝核到BLA的投射纤维在焦虑中没有发挥显著性的效应。为了进一步验证上述结果,我们对C57 BL/6J小鼠的DRN脑区注射携带抑制性光敏通道蛋白Arch的AAV病毒,由CAG启动表达,Arch下游插入增强型的绿色荧光蛋白;同时以不含Arch的AAV病毒作为对照。荧光图片发现在病毒所携带荧光蛋白在背侧中缝核高表达。离体脑片证明了背侧中缝核中Arch的成功表达。589 nm黄光刺激脑片可以记录到神经元的光控诱导外向电流,抑制背侧中缝核神经元可以抑制注射电流所诱导出的动作电位。抑制背侧中缝核到CeA的投射纤维可以减少高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间,同时减少旷场实验中在中央区域所待的时间。然而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的抑制背侧中缝核到CeA的投射纤维可以增加焦虑水平,产生焦虑样的效应。抑制背侧中缝核到BLA的投射纤维对高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间没有影响,同时小鼠在旷场实验中中央区域所待的时间也没有显著性差异。然而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的抑制背侧中缝核到BLA的投射纤维在焦虑中没有发挥显著性的效应。上述结果是在C57 BL/6J小鼠模型上做出的结果,并没有区分背侧中缝核中具体是哪一种神经元投射到杏仁核。考虑到背侧中缝核主要是5-羟色胺能神经元聚集的脑区。我们下一步在5-羟色胺能神经元上特异性表达光通道,看是否和上述结果相一致。我们采用的是Slc6a4-cre转基因小鼠(特异性表达在5-HT神经元),将将携带cre依赖性的DIO的ChR2-mCherry病毒注射到背侧中缝核。免疫荧光结果显示红色荧光与5-羟色胺能神经元特异性标志物TPH2所携带的绿色荧光具有很好的共标。前人报道5-羟色胺能神经元与谷氨酸递质共释放;我们发现照射CeA区域可以记录到兴奋性突触后电流,并且记录到的电流可以被谷氨酸受体阻断剂CNQX所阻断,进一步验证前人的结果。行为学结果如下:和对照相比,CeA脑区注射谷氨酸受体阻断剂可以去除掉由于蓝光刺激导致的开臂时间的增加效应。并且也可以降低由于光刺激导致的旷场试验中央区域的增加。然而,药物处理并没有损害运动能力。这些结果证明蓝光诱导的抗焦虑效应是由于背侧中缝核5-羟色胺能神经元到CeA的投射突触,而不是由于背侧中缝核通过CeA的纤维或者其他。上述结果证明了背侧中缝核到CeA的投射在焦虑样行为中发挥重要作用,那么局部干预CeA神经元是否调节焦虑样行为呢?为了探索杏仁中央核在焦虑当中的作用,我们对Synapsin1-Cre小鼠的CeA脑区注射DIO-ChR2病毒和DIO-Arch病毒。刺激CeA的神经元可以增加高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间,同时增加旷场实验中在中央区域所待的时间,而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的刺激CeA神经元可以降低焦虑水平,发挥抗焦虑样的效应。抑制CeA的神经元可以减少高架十字迷宫实验中小鼠在开臂所待的时间,同时减少旷场实验中在中央区域所待的时间,而小鼠的运动功能并没有受到影响。这些结果显示选择性的抑制CeA神经元可以增加焦虑水平。以上结果表明背侧中缝核到杏仁核的投射纤维,主要是杏仁核CeA区域,参与了焦虑行为的调控,并且CeA局部神经元的活动对焦虑行为的调节也起到重要的作用。这些使我们更深入的了解焦虑环路及其分子细胞机制,有助于理解情感紊乱的病理学机制,并为功能性干预提供一个新的靶点。