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本研究利用实验室已有的池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)转录组数据中表皮生长因子受体底物15(Eps15)基因的部分序列,设计池蝶蚌Eps15基因(Hs-Eps15)基因的特异性引物,并以池蝶蚌性腺组织cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆到pMD19-T载体中,然后转进大肠杆菌DH5α,经测序获得Hs-Eps15基因的部分中间片段,继而通过PCR和3’-RACE PCR最终克隆出Eps15基因序列,其cDNA全长3382bp,包括923bp的3’-UTR,具有24bp长的polyA尾巴及加尾信号AATAA,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2454bp,编码817个氨基酸。对Hs-Eps15蛋白结构域分析得知,N端部分主要由三个EH(Eps15homology)结构域组成,无信号肽,而C端部分最显著的特征是存在多次DPF(谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)重复序列;利用相关生物学软件分析得到其分子量约为88.67kDa,理论等电点为4.88;二级结构预测中显示无规则卷曲和α-螺旋最多,分别占41.74%和41.49%,延伸链占9.55,β-折叠最少。采用MEGA4.0软件邻位相连法(NJ)建立系统进化树分析同源性表明,在众多物种中,池蝶蚌的Eps15基因与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的同源性最高(约64%)。通过荧光定量PCR技术检测分析Hs-Eps15基因在池蝶蚌不同组织中m RNA的表达情况。结果表明:该基因在池蝶蚌心脏、卵巢、精巢、肠、肝胰腺、肾脏、鳃、闭壳肌、外套膜、斧足和血液11个组织中均有表达,其中在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而在心脏、鳃和血液中表达量较低,其中心脏中最低。由此推测池蝶蚌中以Eps15为底物的EGFR通路会影响精子的产生和发育,也会作为池蝶蚌卵巢局部重要的调节因子,影响卵泡生长发育及成熟。根据已得到的Hs-Eps15基因的全长cDNA序列,经NCBI中比对获知序列N端有3个EH结构域,选取这段完整且具有代表性结构域的序列,并对此设计扩增该完整结构域的引物,pEASYTM-E1-Hs-Eps15重组表达质粒,然后转进E.coil BL21(DE3)表达感受态细胞中,经IPTG诱导蛋白表达,得到了分子量约为32.6kDa的融合蛋白。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达产物,SDS-PAGE检测显示获得了纯净的融合蛋白,Bradford法测定蛋白浓度及含量,测定结果显示蛋白浓度符合制备多克隆抗体的要求。利用纯化的Hs-Eps15融合蛋白作为抗原免疫日本长耳兔,制备多克隆抗体,ELISA间接法检测抗血清效价在1:512000以上。经Western blotting检测得知制备的多克隆抗血清能够特异性识别纯化的Hs-Eps15融合蛋白。最后做池蝶蚌成熟性腺及肝胰腺的冰冻切片,用制备的兔抗血清对Hs-Eps15蛋白在细胞内表达进行免疫荧光定位,结果发现在池蝶蚌的精子中,Eps15蛋白主要分布在精子头部位置,在池蝶蚌卵细胞中,Eps15蛋白主要分布在细胞核膜上,而在肝胰腺细胞中Eps15蛋白主要分布在核膜和胞质中,为从蛋白水平研究Hs-Eps15的功能及此信号通路上其他相关蛋白的定位奠定了基础。