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人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)是一种由ErbB基因编码的酪氨酸激酶受体膜糖蛋白。HER2属于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族成员。HER2表达异常时,正常细胞和组织易于发生癌变,导致肿瘤形成。已知在人类多种肿瘤中,包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等,都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象。近年来,靶向HER2的抗体药物已经成为HER2阳性肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等人源化抗HER2单克隆抗体在临床上治疗HER2高表达乳腺癌、胃癌等具有较好的治疗效果。大量研究表明,靶向HER2的单克隆抗体药物可以通过直接机制和间接机制发挥抗肿瘤作用,但临床应用中发现,相当部分肿瘤病人对曲妥珠单抗(trastuzumab, Tra)和帕妥珠单抗(pertuzumab, Per)初始治疗无效,或者治疗一段时间后产生耐药性,肿瘤复发,因此迫切需要开发具有新型识别表位和作用机制的抗HER2抗体药物,以及新的抗体药物联用方案,以满足临床需求,提高肿瘤治疗效果。我们前期构建了一个人鼠嵌合单链抗体融合蛋白(chimeric single-chain antibody) chA21,该抗体在体内外对人乳腺癌细胞株BT-474、SKBR3具有一定的抑制能力。HuA21抗体是通过对chA21抗体进行人源化改造、亲和力成熟的抗HER2抗体,HuA21抗体识别表位位于HER2胞外区I区的抗HER2抗体。本课题运用背景明确的HER2高表达肿瘤细胞株(人乳腺癌细胞株BT-474、SKBR3,人卵巢癌细胞株SKOV3,人胃癌细胞株OE-19)及自行构建的HER2高表达曲妥珠单抗耐药的肿瘤细胞株(BT-474/HR)、人乳腺癌细胞株(MCF-7/HER2)及小鼠乳腺癌细胞株(4T1-HER2-Luci),研究HuA21的抗肿瘤作用及其作用机制,为HuA21抗体单用或者与其他肿瘤靶向药物联用的新型治疗方案提供实验依据。目的：体内外观察HuA21抗体抗HER2高表达肿瘤的活性,研究HuA21抗体作用于EGFR家族受体功能和信号转导的分子机制,为具有新型作用机制的抗HER2人源化抗体HuA21开发和应用提供实验依据。方法：1.建立MCF-7/HER2稳定转染人乳腺癌细胞株,建立对曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR人乳腺癌细胞株,同时在体外研究HuA21抗体对HER2高表达肿瘤细胞的作用2.建立 MCF-7/HER2人乳腺癌细胞株,HER2高表达BT-474及对曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR人乳腺癌细胞株,HER2高表达人卵巢癌细胞株SKOV3,HER2高表达OE-19人胃癌细胞株原位移植瘤模型BT-474组及BT-474/HR组各选取24只Balb/c雌性裸鼠,胸部乳房垫皮下注射5x106个细胞(0.05m1血清培养基+0.05m1Matrigel),双侧注射,同时包埋半片0.72mg 17β雌二醇60天缓释片。最终BT-474组及BT-474/HR组最终各选取20只,随机分为4组：对照组,曲妥珠单抗组(10mg/kg),HuA21组(10mg/kg)、chA21组(10mg/kg))。BT-474组平均肿瘤体积约130-140mm3,BT-474/HR组平均肿瘤体积约160mm3,给药体积均为0.1ml,每周2次。对照组给予生理盐水,每周测量2次肿瘤体积。MCF-7/HER2组选取32只Balb/c雌性裸鼠,乳房垫皮下注射1x107个细胞0.1ml血清培养基,单侧注射,同时包埋半片0.72mg 17β雌二醇60天缓释片。最终选取28只小鼠随机分为4组(每组7只)：对照组,曲妥珠单抗组(20mg/kg),HuA21组(20mg/kg)、chA21组(20mg/kg),平均肿瘤体积约110-130mm3,给药体积0.1ml(按照每只小鼠20g计算),每周2次。对照组给予生理盐水,每周测量2次肿瘤体积。SKOV3组选取22只Balb/c雌性裸鼠,胁部皮下双侧注射5x106个细胞。最终选取20只小鼠随机分为4组(每组5只)：对照组,曲妥珠单抗组(30mg/kg),HuA21组(30mg/kg)、chA21组(30mg/kg),平均肿瘤体积约70-80 mm3。给药体积0.1ml(按照每只小鼠20g计算),每周2次。对照组给予生理盐水。每周测量2次肿瘤体积。OE-19组选取26只Balb/c雌性裸鼠,胁部皮下双侧注射5x106个细胞。开始给药：最终选取24只小鼠分为4组(每组6只)：对照组,曲妥珠单抗组(20mg/kg),HuA21组(20mg/kg)、chA21组(20mg/kg),平均肿瘤体积约76-80 mm3,给药体积0.1 ml(按照每只小鼠20g计算),每周2次。对照组给予生理盐水,每周测量2次肿瘤体积。肿瘤体积(TV)计算公式：TV=1/2×a×b2,其中a、b分别表示长径(长)、短径(宽)。相对肿瘤体积(RTV)计算公式：RTV=Vt/V0。其中V0为分组给药时(即d0)肿瘤体积,Vt为每一次测量时肿瘤体积。肿瘤增殖率T/C,计算公式：T/C= (TRTV/CRTV)。 TRTV:治疗组RTV；CRTV:阴性对照组RTV。以此作为主要的抗肿瘤活性的评价指标。瘤体积抑制率=(对照组瘤体积-给药组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。瘤重抑制率=(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100%。3.体外研究HuA21对BT-474及BT-474/HR细胞株HER2受体及下游信号通路的影响BT-474及BT-474/HR分别以5x106细胞铺6cm皿48h后分两种情况处理：在10%血清条件下加入10μg/ml不同抗体单用或联用(PBS,曲妥珠单抗,HuA21,HuA21+曲妥珠单抗)；收集细胞裂解液。Western Blotting检测HER2,EGFR,HER3,Erk,Akt,pHER2, pHER3, pErk, pAkt, β-acting。采用免疫荧光法及激光共聚焦检测肿瘤细胞BT-474,SKBR3, SKOV3对人源化抗体HuA21的结合能力及内吞能力,采用流式细胞仪检测抗体内吞。4.研究HuA21体内抗肿瘤转移能力4T1-HER2-Luci组共选取18只Balb/c雌小鼠,调整活细胞浓度为5×105个,接种于Balb/c小鼠乳房垫内。在Balb/c小鼠接种细胞2周后,随机分为3组,分对照组、HuA21组(30mg/kg)、曲妥珠单抗组(30mg/kg),对照组给予生理盐水,实验终点时小鼠腹腔注射200μl体积的荧光素酶底物,15分钟后,对小鼠进行异氟烷麻醉,置于小动物活体成像仪观察并拍照。5.统计分析采用SPSS 17.0软件对数据进行分析。计量资料用均数±标准差(x±s)进行描述,组间比较采用单因素方法分析和T检验,显著性差异标准设为P值<0.05为有效。结果：1.建立MCF-7/HER2细胞株,构建曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌BT-474/HR,并将两细胞株运用于随后开展的药效学实验中。2.HuA21抗体体外对BT-474乳腺癌细胞、曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR乳腺癌细胞、SKOV3卵巢癌细胞、OE-19胃癌细胞均有增殖抑制作用,对BT-474/HR增殖抑制效果优于曲妥珠单抗,同时HuA21抗体能有效介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。体内肿瘤抑制试验显示,与对照组相比,人源化抗体HuA21抗体对BT-474乳腺癌、曲妥珠单抗耐药BT-474/HR乳腺癌、MCF-7/HER2乳腺癌、SKOV3卵巢癌、OE-19胃癌等细胞均有明显的抑制作用。3.体外细胞实验显示HuA21抗体在BT-474乳腺癌细胞、曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR乳腺癌细胞均能够下调HER2、Erkl/2和Akt的磷酸化水平,HuA21抗体在两种细胞株中对Erkl/2磷酸化水平下调程度较曲妥珠单抗强,在曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR乳腺癌细胞中HuA21抗体对HER2、Erkl/2和Akt的磷酸化水平下调能力较曲妥珠单抗强。HuA21抗体在BT-474细胞和BT-474/HR细胞中均能下调HER2,EGFR水平。HuA21抗体和曲妥珠单抗均能与肿瘤细胞表面的HER2受体特异性结合,但肿瘤细胞对这两种抗体的内吞能力有明显差别,肿瘤细胞对HuA21抗体的内吞能力大于肿瘤细胞对曲妥珠单抗的内吞能力。4.HuA21抗体对含有荧光素酶基因的小鼠乳腺癌细胞系4T1-HER2-Luci具有良好的抗肿瘤生长和转移的作用。结论：1.体外HuA21抗体对HER2高表达肿瘤细胞均具有较强的抑制作用,体内HuA21抗体对HER2高表达及曲妥珠单抗耐药的肿瘤具有一定的抑制作用,同时HuA21抗体在荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞系4T1-HER2-Luci荷瘤模型中具有良好的抗肿瘤生长和转移的作用。2.HuA21抗体抗肿瘤机制可能与其肿瘤细胞对人源化抗体HuA21抗体的内吞能力较强、下调Erk1/2和Akt的磷酸化水平有关,且在曲妥珠单抗耐药的BT-474/HR乳腺癌细胞中对HER3、Erk1/2和Akt的磷酸化水平下调能力较强,与曲妥珠单抗联用效应更强。3.本课题通过研究HuA21抗体不同于曲妥珠单抗在抑制肿瘤和体内转移方面的作用特点及分子机制,有助于指导HuA21抗体药物临床试验方案的制定,为具有新型作用机制的抗HER2人源化抗体HuA21开发和应用提供实验依据。