目的：　　1．探讨以外泌体为基础的肿瘤液体活检在子宫内膜癌的早期诊断中的应用价值。外泌体携带miRNA作为疾病诊断的分子生物学标志物已逐渐成为研究热点。应用高通量测序技术初步探讨子宫内膜癌患者血清外泌体miRNA的分子谱。进一步在子宫内膜癌细胞系及子宫内膜癌患者血清中进行验证，确定表达水平高的miRNA并通过生物信息学及双荧光素酶实验确定其靶基因，在组织水平上研究靶基因在子宫内膜癌中的表达情况。　　2. 肿瘤微环境在肿瘤的发生发展中起重要的作用，肿瘤细胞来源的外泌体分泌到微环境中并通过多种途径参与肿瘤微环境中发挥重要的作用，通过旁分泌、自分泌等促进肿瘤侵袭和转移。内皮细胞作为肿瘤微环境中的重要组成部分，发生内皮间质转化（EndoMT）后调节肿瘤微环境促进肿瘤血管新生和转移。本实验将肿瘤来源的外泌体与内皮细胞共培养，探讨外泌体携带miRNA 在内皮间质转化中的作用机制的研究及对正常内皮细胞功能的影响，并进一步探讨转染miRNA mimic和inhibitor对子宫内膜癌细胞作用机制及功能的研究。　　方法：　　1.应用高通量测序技术检测3例子宫内膜癌患者和3例正常人血清外泌体中微小RNA表达的差异，以表达差异倍数大于2倍作为有统计学意义。将杂交芯片结果绘制箱线图、散点图及主成分分析图对数据进行分析，根据筛选差异miRNA的结果，绘制火山图；利用数据库对差异miRNA进行靶基因的预测及GO和KEGG分析，并对差异miRNA进行聚类分析，绘制热图。初步确定子宫内膜癌患者血清微小RNA的表达谱。将内膜癌细胞应用无外泌体血清的培养基培养2天，换液1次继续培养2天后应用SBI的外泌体抽提试剂盒提取外泌体，将外泌体稀释后应用透射电镜观察外泌体的形态、粒度仪分析外泌体的直径、Western Blot检测外泌体膜表面的CD63对提取的外泌体进行鉴定分析。应用实时荧光定量PCR对3种不同子宫内膜癌细胞（ishikawa、HEC-1A、HEC-1B）及外泌体和50例子宫内膜癌（病理类型为子宫内膜样腺癌，I型子宫内膜癌、高分化20例、中分化20例、低分化10例）及50例健康对照组血清外泌体的差异miRNA进行验证；应用双荧光素酶实验验证靶基因，应用的质粒的类型包括miRNA-NC、miRNA、3 UTR-NC、3 UTR、3 UTR-MU、阳参3 UTR、阳参miRNA。双荧光素酶的实验分组如下：实验组1：3 UTR-NC+miR-451a-NC；实验组2：3 UTR-NC+miR-451a；实验组3：3UTR+miR-451a-NC；实验组4：3 UTR+miR-451a；实验组5：3 UTR-MU+miR-451a-NC；实验组 6：3 UTR-MU+miR-451a；阳参 miRNA NC 组：阳参 TRAF6 3 UTR+miR-146b-NC；阳参miRNA 组：TRAF6 3 UTR+阳参miR-146b。构建载体并行酶切，PCR鉴定重组克隆结果，将阳性克隆测序结果与目标序列进行比对。质粒转染293T细胞，转染48 h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，并判断转染效率；然后行luciferase 检测。应用免疫组织化学的方法检测靶基因CMTM6在子宫内膜癌患者及正常内膜中的表达情况，并与分期、分级、病理类型等临床病理特点等进行分析。　　2.提取内膜癌细胞的外泌体与内皮细胞共培养，Western Blot检测内皮间质转化的相关蛋白标志物：血管内皮-钙粘蛋白（VE-cadherin），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）的变化及血管内皮生长因子（VEGFA）的变化；同时应用实时荧光定量PCR检测外泌体作用于内皮细胞后miR-451a表达水平的变化和Western Blot检测靶基因CMTM6的变化；Transwell实验和划痕愈合实验检测共培养后内皮细胞迁移能力的改变；应用miR-451a mimic/inhibitor分别转染子宫内膜癌细胞进行增殖、迁移、侵袭等功能试验的研究， CCK-8细胞增殖实验检测应用miR-451a mimic/inhibitor后细胞增殖能力改变，Transwell实验和划痕愈合实验检测细胞侵袭和迁移能力的改变。　　结果：　　1.通过对子宫内膜癌患者血清外泌体中的miRNA进行高通量测序的结果提示有显著性上调或下调差异的miRNA主要表现为15种miRNA，其中12种miRNA上调， 3 种 miRNA 下调。具体如下：上调的 miRNA 为 hsa-miR-6892-5p；hsa-miR-6739-5p；hsa-miR-631；hsa-miR-3124-5p；hsa-miR-4261；hsa-miR-6870-5p；hsa-miR-451a；hsa-miR-10a-5p；hsa-miR-770-5p；hsa-miR-6803-3p；hsa-miR-6743-3p；hsa-miR-3127-5p；下调的miRNA为hsa-miR-665；hsa-miR-6772-5p；hsa-miR-501-3p。对提取的外泌体进行鉴定电镜下见到直径在30-100nm的囊泡结构，具有茶托样或凹半球样结构。Western Blot检测到外泌体膜上CD63蛋白的表达。实时荧光定量PCR对子宫内膜癌细胞及外泌体的11种差异miRNA进行验证，提示在子宫内膜癌细胞本身及外泌体中有三种miRNA表达差异明显，具有统计学意义（P＜0.05），分别为miR-451a、miR-770、miR-4261。这三种差异miRNA在50例子宫内膜癌患者及健康对照组血清中外泌体行实时荧光定量PCR的验证提示miR-451a的表达差异最明显，具有统计学意义（P＜0.05）。双荧光素酶验证的结果提示，在相同的miRNA质粒的作用下，CMTM6 3 UTR组较CMTM6 3 UTR空载组和CMTM6 3 UTR突变质粒luciferase的表达明显下降（ P＜0.01 ） ，说明miR-451a与靶基因CMTM6 的3 UTR结合，抑制 CMTM6 的表达。同时阳参 miR-146b 组与阳参miR-146b NC 组相比，阳参 miR-146b 组相对luciferase 的表达量有显著性下降(P<0.05)，说明整个转染检测的过程和体系是正确的。综上实验提示miR-451a的靶基因为CMTM6，且可以降低靶基因CMTM6的表达。免疫组化半定量分析结果提示在正常内膜中CMTM6的阳性表达率为100%，子宫内膜癌表达率为40%，两者表达率相比差异有统计学意义（χ2=36.000，P<0.001）；高分化与中低分化相比表达率差异有统计学意义（P＜0.05）。CMTM6的表达与子宫内膜癌的分期、年龄、病理类型等无明显的差异。　　2.内膜癌来源的外泌体与内皮细胞共培养48小时后，Western Blot检测内皮间质转化的相关蛋白标志物：提示VE-cadherin的表达明显下降，而间质的标志物α-SMA及Vimentin的表达明显增加，提示加入内膜癌细胞来源的外泌体后促进了内皮细胞的内皮间质转化。同时VEGFA的表达也明显升高（P＜0.05），提示内膜癌来源的外泌体促进了血管生成能力；实时荧光定量PCR检测外泌体作用于内皮细胞后miR-451a表达水平升高（P＜0.05），Western Blot检测靶基因CMTM6的蛋白表达下降（P＜0.05）；Ishikawa及HEC-1B来源的外泌体作用于正常的受体细胞（内皮细胞）后对细胞迁移能力的影响。Transwell细胞迁移实验，内皮细胞中加入肿瘤来源的exosomes后OD570的值明显高于对照组，迁移能力增强，差异均具有统计学意义（P<0.05）。划痕愈合实验提示内皮细胞中加入子宫内膜癌细胞来源的外泌体后，ΔS%/h均高于空白对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。miR-451a家族以mimic/mimic control、inhibitor/inhibitor control分别转染子宫内膜癌细胞系Ishikawa及HEC-1B，结果提示：模拟物/抑制物阴性对照组与空白对照组相比，差异无统计学意义；miR-451a inhibitor转染组OD450低于空白或阴性对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），miR-451a mimic转染组OD450高于空白或阴性对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。子宫内膜癌细胞系转染miR-451a模拟物（mimic）后检测细胞侵袭能力，转染24h后Ishikawa及HEC-1B的侵袭能力较对照组增强， OD570均高于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。子宫内膜癌细胞系转染miR-451a inhibitor后检测细胞侵袭能力较对照组减慢，差别有统计学意义（P＞0.05）。划痕愈合实验作用24h后Ishikawa及HEC-1B的迁移能力较对照组增强，ΔS%/h均高于空白对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。子宫内膜癌细胞系转染miR-451a inhibitor后检测细胞迁移能力较对照组减慢，但无明显统计学意义（P＞0.05 ）。综上CCK-8细胞增殖实验、Transwell实验和划痕愈合实验提示在应用miR-451a mimic转染后细胞增殖能力、侵袭和迁移能力的增强，而在应用miR-451a inhibitor转染后增殖、迁移和侵袭能力减弱。　　结论：　　1.外泌体携带miR-451a通过靶向CMTM6影响内皮间质转化，促进内皮细胞的迁移，可促进血管生成及转移。　　2.miR-451a影响子宫内膜癌细胞的功能，参与子宫内膜癌的发生发展，可作为潜在的治疗靶点。　　3.基于高通量测序的子宫内膜癌患者血清外泌体miR-451a升高可作为子宫内膜癌早期诊断的潜在分子生物学指标。