人们对肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)的认识过程起源于对肝再生现象的研究。肝脏再生的特殊性使其无论在临床应用中还是在理论研究上都具有巨大的研究价值，激发了人们研究的热情。其中肝脏再生的启动与调控机理尤引人注目。1975年，LaRrecque等首次证实了在断乳乳鼠的肝脏和肝部分切除后的大鼠再生肝脏中，存在一种能特异刺激肝细胞DNA合成的物质，命名为肝刺激物质(hepatic stimulatory substance, HSS)。1993年，本实验室证明人胎肝中存在同类分子，并揭示其为肝细胞基因表达的产物。Hagiya等于1994年发表了大鼠肝再生增强因子(rALR)的分离、纯化与分子克隆的研究结果。本实验室根据大鼠ALR的cDNA序列从人胎肝cDNA文库中获得了肝细胞生成素(hepatopoietin, HPO )的全长cDNA，继而在国际上率先研制出重组人肝细胞生成素(rhHPO)。HPO最初是从再生肝实质细胞胞浆中发现的肝源性生长因子，对同胚层来源的肺、肾脏、脾脏等器官没有增殖刺激作用，并且HPO在睾丸中也有特异高表达，虽然有报导表明ALR在大鼠的精子发生中有重要作用，但机制尚不明了。HPO在肝细胞内有两种存在形式，<WP=5>分子量分别为15 kDa和23 kDa。它们在肝细胞中的分布不同：15 kDa的HPO只存在于胞核中；23 kDa的HPO既存在于胞核，也存在于胞浆中，但主要在胞浆中。本室前期工作证明，在肝细胞表面存在HPO特异性受体，但在其它组织来源的细胞膜上未发现 HPO受体。以自分泌方式（autocrine）分泌到胞外的HPO通过肝细胞表面受体，在EGF受体的介导下，以丝裂原活性调节肝细胞的增殖并激活胞内MAPK信号转导通路。最近，我们又发现胞内生长因子HPO在辅助激活因子JAB1的介导下能够激活AP-1通路，并且该作用不依赖于MAPK信号途径的激活，也不依赖于JNK途径的活化（即c-Jun磷酸化水平的增强）。但是，HPO受体至今尚未成功克隆，HPO胞内胞外的细胞因子作用的分子机制还不是很清楚。我们在前期工作的基础上展开了进一步的探索。ERV1(essential for respiration and vegetative growth)基因是HPO在啤酒酵母中的直系同源基因。ERV1/ALR/HPO同源物在自然界中广泛分布：病毒、原生动物、昆虫、蛔虫、高等植物、高等动物中都存在其同源基因，通称为ERV/ALR家族。近期研究表明，ERV /ALR/HPO家族成员ERV1、ERV2及E10R均属于一类FAD巯基氧化酶(FAD-linked sulfhydryl oxidase)，可催化还原态蛋白质的自由巯基形成二硫键。它们的蛋白序列中都具有一个保守的CXXC (Cys-Xaa-Xaa-Cys)模体(motif)，蛋白链上都以非共价键结合了一分子FAD。CXXC模体的两个半胱氨酸(Cys)形成一个氧化还原的活性二<WP=6>硫键，以FAD作为递氢体，将底物蛋白上一对自由巯基的氢传递到O2上，催化反应最终生成一分子H2O2 及底物蛋白上的一个二硫键。23 kDa的HPO在酵母内可以替代ERV1p的功能，在人肝细胞中也定位于线粒体上。我们推测，主要存在于肝细胞胞浆的23 kDa HPO可能与ERV1有着相同的功能，即参与胞质Fe/S簇的聚集和Fe/S蛋白的成熟。而15 kDa HPO主要发挥其细胞因子作用，参与胞内及胞外的信号转导途径的调节。那么，HPO的胞内胞外作用有什么联系、如何统一， ERV/ALR/HPO家族蛋白的巯基氧化酶催化活性是否与HPO细胞因子功能相关，作为巯基氧化酶的HPO的生理底物又是什么，这都成为我们关注的新焦点。1. HPO 的链内二硫键分析及其与HPO巯基氧化酶活性的关系为了验证15 kDa HPO的巯基氧化酶活性以及保守CXXC模体是否是HPO的酶活性中心（enzyme active site），在前期对重组HPO蛋白的结构研究基础上，我们对HPO二硫键状态进行了质谱分析。结果显示HPO存在两个链内二硫键，它们分别由Cys-67与Cys-70、Cys-90与Cys-96形成。其中Cys-67与Cys-70正是CXXC模体中的两个半胱氨酸，该链内二硫键与ERV/ALR家族其它成员的巯基氧化酶的活性二硫键的报导一致。接着，我们利用点突变的方法构建了HPO的一系列CXXC位点Cys→Ser的突变体，用E. coli BL-21细胞进行原核表达。羧基端带有组氨酸标签（His-tag）的HPO野生型和突变体融合蛋白经纯化后用于FAD的结合测定实验及体外巯基氧<WP=7>化酶活性测定实验（采用目前公认的“Ellman’s reagent法”测量底物自由巯基数的改变以测定巯基氧化酶活性）。结果表明，原核表达的HPO野生型和突变体都结合了FAD分子，野生型HPO具有巯基氧化酶活性，而CXXC突变的HPO则完全丧失其酶活性，CXXC模体是HPO酶活必需的结构。2. CXXC对HPO-HPO自身及HPO-JAB1相互作用的影响ERV/ALR家族成员在生物体内通常是以二聚体的形式存在并与其生理功能密切相关。本室前期研究证明HPO能够在体内及体外形成二聚体且与胞外/胞内HPO的细胞因子活性相关。此外，HPO对AP-1的激活依赖于HPO-JAB1的相互作用，因此我们分别检测了真核表达和原核表达的HPO（野生型和突变体）的二聚体状态，通过酵母双杂交实验、His-pull down实验和免疫共沉淀实验观察了HPO（野生型和突变体）与JAB1的结合情况。结果表明CXXC的突变不影响HPO二聚体的形成，也不影响HPO与JAB1的结合。3. HPO巯基氧化酶活性与其胞内/胞外细胞因子作用的关系