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研究背景:宫颈癌是常见的生殖系统恶性肿瘤,严重危害妇女的身心健康,其发生发展是在一系列致癌因素共同作用下,细胞的生长调控发生严重紊乱的结果。越来越多的证据证明,包括宫颈癌在内的恶性肿瘤的发生发展除了与癌基因异常激活和抑癌基因失活有关,还与生长因子、生长因子受体、信号转导蛋白等调节因子的基因异常有关。成纤维生长因子受体（FGFR）是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白,在组织细胞中广泛分布,参与细胞增殖、凋亡、分化、血管生成、侵袭等多个过程。FGFR的异常表达与乳腺癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤密切相关,已有研究证实宫颈癌组织中不仅存在FGFR的高表达,而且FGFR的表达与临床分期、淋巴结转移等有关,因此推测FGFR可以作为宫颈癌的治疗靶点。NVP-BGJ398作为FGFR的靶向抑制剂,可以特异性的抑制FGFR的酪氨酸激酶活性,在部分实体肿瘤中已经进入II期临床实验阶段。但目前尚未见NVP-BGJ398联合顺铂对宫颈癌作用的研究,且对详细的作用机制尚不清楚。目的:1.研究成纤维细胞生长因子受体抑制剂NVP-BGJ398联合顺铂对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响;2.探索NVP-BGJ398联合顺铂影响宫颈癌HeLa细胞的机制。方法:1.分别用终浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、30、40μmol/L的NVP-BGJ398（FGFR特异性阻断剂）、终浓度为0、10、20、30、40、50μmol/L的顺铂单独处理宫颈癌HeLa细胞24、48、72h,采用CCK-8细胞增殖毒性试剂盒测定各组HeLa细胞的OD值,并计算增殖抑制率和IC30和IC50,根据结果选择合适的药物浓度用于后续实验。2.根据第一步CCK-8的结果,选择12.5μmol/L NVP-BGJ398和12.5μmol/L顺铂作为后续实验的浓度。培养HeLa细胞,将HeLa细胞分为对照组、NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组,对照组加入不含顺铂和NVP-BGJ398培养基,NVP-BGJ398组加入含有12.5μmol/LNVP-BGJ398的培养基,顺铂组加入含有12.5μmol/L顺铂的培养基,联合组加入同时含有12.5μmol/L NVP-BGJ398和12.5μmol/L顺铂的培养基。按照上述分组分别加药处理24、48、72h,再次用CCK-8法检测各组细胞的OD值,计算各组细胞的增殖抑制率,用金正均q值公式计算NVP-BGJ398与顺铂联合作用的q值,探索联用方案的有效性。3.分组加药处理HeLa细胞48h后,用倒置光学显微镜观察各组HeLa细胞的形态变化。4.分组加药处理HeLa细胞48h后,用流式细胞仪检测各组HeLa细胞凋亡率,探索NVP-BGJ398与顺铂单独或联合作用对HeLa细胞凋亡的影响。5.分组加药处理HeLa细胞48h后,用Transwell小室检测HeLa细胞穿膜细胞数量,探索NVP-BGJ398与顺铂单独或联合作用对HeLa细胞侵袭能力的影响。6.Western blotting检测各组增殖相关蛋白PCNA、凋亡相关蛋白Bax、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、E-钙粘附蛋白（E-cadherin）的表达。7.Western blotting检测各组HeLa细胞PI3K/AKT信号通路蛋白p-AKT、AKT以及MEK/ERK信号通路蛋白p-ERK1/2、ERK1/2的表达水平。8.SPSS软件统计分析,计数资料采用方差齐性检验,各组的抑制率用析因方差分析,同一时间点不同浓度之间、同一浓度不同时间点之间比较均用单因素方差分析。两两比较若方差齐时用LSD法检验,若方差不齐,则用Dunnett’s T3检验,p<0.05为差异有显著性。结果:1.CCK-8结果显示,0-5μmol/L的NVP-BGJ398处理HeLa细胞24-72h对细胞增殖无明显抑制作用,抑制率最高为（6.88?2.07）%,各浓度组的增殖抑制率两两比较均无显著性差异（p均>0.05）;10-40μmol/L的NVP-BGJ398在同一时间点不同浓度之间的抑制率两两比较均有显著差异（p<0.05）,随着NVP-BGJ398浓度增加,抑制率逐渐升高,抑制作用呈浓度依赖性;10、20、30μmol/L的NVP-BGJ398,同一浓度下不同时间点的抑制率两两比较均有显著差异（p均<0.05）,随着作用时间延长,增殖抑制率逐渐升高,抑制作用呈时间依赖性,当NVP-BGJ398浓度达40μmol/L时,作用48h与72h相比,抑制率不再随着作用时间的延长而出现明显升高（p>0.05）。这一结果说明在一定范围内,NVP-BGJ398对HeLa细胞的增殖抑制作用呈浓度和时间依赖性。2.CCK-8结果显示,10μmol/L的顺铂作用HeLa细胞48h和72h,细胞的增殖抑制率无明显差异（p=0.090）,余同一浓度不同时间点的各组间两两比较有显著差异（p均<0.05）,随着顺铂作用时间延长,各浓度组增殖抑制率逐渐升高,抑制作用有浓度依赖性;10-40μmol/L的顺铂在同一时间点不同浓度间两两比较均有显著差异（p<0.05）,随着顺铂浓度增加,细胞增殖抑制率逐渐升高;但不是顺铂浓度越高,抑制作用就越强,当顺铂浓度达50μmol/L时,无论是作用48h还是72h,与40μmol/L相比差异无明显差异（p均>0.05）。说明顺铂对HeLa细胞的增殖抑制作用呈一定的浓度和时间依赖性。3.根据CCK-8结果,计算得到NVP-BGJ398作用24、48、72h的IC50依次为21.69?1.25、16.88?0.63、13.60?0.16μmol/L,IC30依次为16.04?1.42、12.15?0.16、9.75?0.17μmol/L。顺铂作用24、48、72h的IC50依次为36.70?0.27、18.85?0.71、15.03?0.23μmol/L,IC30依次为25.12?0.48、12.31?1.80、9.63?0.23μmol/L。NVP-BGJ398的IC50显著低于顺铂（p<0.05）,对HeLa细胞的抑制作用强于顺铂,选择NVP-BGJ39812.5μmol/L、顺铂12.5μmol/L作为后续实验的浓度。4.CCK-8结果显示,相同作用时间下,NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组的增殖抑制率均显著高于对照组（p<0.01）,联合组的增殖抑制率显著高于NVP-BGJ398组和顺铂组（p<0.01）;联合组的增殖抑制率随着作用时间延长逐渐升高（p<0.001）,通过金正均q值法计算,联合组24、48、72h的q值依次为0.89、0.86、0.96,由此可见NVP-BGJ398联合顺铂主要为相加作用,联合组抑制增殖的作用明显强于单独用药组。5.流式细胞仪检测各组细胞凋亡率显示,对照组、NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组的凋亡率依次为（5.01?0.89）%、（18.70?0.53）%、（16.40?0.44）%、（26.73?0.64）%。NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组的凋亡率显著高于对照组（p均<0.001）,而联合组的凋亡率明显高于NVP-BGJ398组和顺铂组,差异有统计学意义（p均<0.001）。说明NVP-BGJ398与顺铂单独或联合均可促进HeLa细胞凋亡,联合组促进凋亡的作用明显强于单独用药组。6.Transwell小室检测细胞侵袭能力结果显示,对照组、NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组穿过Transwell小室的细胞数依次为143.93?1.51、95.80?5.21、121.67?2.71、44.86?4.95个。NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组的穿膜细胞数明显低于对照组（p均<0.01）,而联合组的穿膜细胞数明显低于NVP-BGJ398组和顺铂组（p均<0.01）,说明NVP-BGJ398、顺铂均能抑制HeLa细胞的侵袭能力,二者联合作用时抑制作用最强。7.Western blotting检测结果显示,与对照组相比,NVP-BGJ398组、顺铂组及联合组PCNA、MMP-2的表达量均明显降低（p<0.01）,Bax、E-cadeherin蛋白的表达量均明显升高（p<0.01）;联合组PCNA、MMP-2蛋白的表达量均明显低于NVP-BGJ398组、顺铂组（p<0.01）,Bax、E-cadeherin蛋白的表达量均明显高于NVP-BGJ398组、顺铂组（p<0.05）;说明NVP-BGJ398与顺铂均能下调PCNA、MMP-2、上调Bax、E-cadeherin蛋白的表达,二者联合时作用最强。8.Western blotting检测结果显示,与对照组相比,NVP-BGJ398组、顺铂组、联合组的p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表达量明显降低（p<0.001）,但ERK1/2和AKT蛋白的表达量无明显变化,差异无统计学意义（p>0.05）。联合组p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表达量明显低于NVP-BGJ398组和顺铂组（p<0.01）。由此可见,NVP-BGJ398与顺铂均能抑制AKT和ERK1/2的磷酸化,二者联合作用效果最明显。结论:1.NVP-BGJ398通过抑制成纤维生长因子受体,可以有效抑制HeLa细胞的增殖、侵袭和促进凋亡,成纤维生长因子受体与宫颈癌有广泛联系。2.NVP-BGJ398与顺铂单独或联合均可抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭能力,NVP-BGJ398与顺铂联合时表现为相加作用。3.NVP-BGJ398与顺铂联合作用的机制为通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路,抑制P-AKT、P-ERK的蛋白的表达,进一步下调PCNA、MMP-2蛋白的表达,上调Bax、E-cadeherin蛋白的表达。