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Usher综合征(Usher syndrome,USH)又称遗传性耳聋-视网膜色素变性综合征,以先天性耳聋和进行性的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)为主要临床特征,有时也伴有平衡觉障碍。Usher综合征的遗传方式为常染色体隐性。临床上,根据耳聋程度的不同,以及前庭功能受损情况,Usher综合征可分为USH1、USH2、USH3三种亚型。USH具有广泛的遗传异质性,目前已鉴定出13个致病基因。USH2是USH最为常见的亚型,其患者占发病人口总数的50%以上,而约70%的USH2则是由于USH2A基因突变导致的。USH2A基因在1994年被定位于1号染色体长臂,1998年Eudy等首次通过定位克隆鉴定了USH2A基因。目前已被鉴定出的USH2A突变多达400多个,遍布于整个USH2A外显子和内含子区域。USH2A基因有两个转录本—isoform＿a和isoform＿b。Isoform＿a包含21个外显子,其产物大小约170 k Da;Isoform＿b含有72个外显子,编码产物usherin是一个600 k Da的跨膜蛋白。Isoform＿a即为isoform＿b的前21个外显子,主要在基底膜表达。而在视网膜和内耳,isoform＿b则是主要的存在形式。Usherin蛋白(USH2A)的C末端位于细胞膜内,具有PDZ结合结构域(PBM);位于胞外的巨大部分则含有多种在胞外基质蛋白中常见的结构域。目前对于USH2A突变导致USH2的病理机制尚不清楚,且没有有效治疗手段,USH2A基因敲除小鼠模型也并未阐释出USH2A在视网膜的具体功能。为进一步揭示USH2A突变导致USH2的机理,我们利用TALEN技术构建了USH2A基因敲除的斑马鱼模型并进行探究。斑马鱼USH2A蛋白与人类USH2A具有52%的序列一致性,结构域排布也相似。利用USH2A敲除(USH2A-/-)斑马鱼模型,我们首先采用惊恐反射实验进行听力检测。听力测试结果显示USH2A-/-斑马鱼具有早发的、非进行性的听力下降,这种听力上的损伤是由于内耳静纤毛数量减少、形态异常导致的。听力方面的表型与USH2A敲除的小鼠及人类患者非常相似。视觉方面,幼鱼视网膜电图(ERG)检测发现USH2A敲除使得斑马鱼视力轻度损伤。视网膜组织学检测发现,在10月龄之后,USH2A-/-斑马鱼的感光细胞开始逐渐退化,然而这种退化进行地十分缓慢,20个月时与10个月相比也并未出现明显恶化。透射电子显微镜(TEM)观察显示感光细胞的退化主要发生在外节。视杆外节的退化要先于视锥退化出现,这与视网膜色素变性过程的描述是一致的。USH2A基因的功能研究方面,首先在m RNA和蛋白水平对光转导过程相关的基因进行检测,发现在斑马鱼中USH2A基因敲除并不直接影响光转导过程。然而,USH2A-/-斑马鱼感光细胞外节的退化会导致光转导蛋白的表达下调,这种下调可能是导致成年USH2A-/-斑马鱼视力退化的重要原因之一。考虑到其它研究中证实USH2A蛋白的LE结构域可与纤连蛋白相互作用,而纤连蛋白是胞外基质的一种重要成分,可维持基底膜的稳定性,因而我们探究了USH2A敲除对视网膜纤连蛋白及胞外基质是否会产生影响。利用纤连蛋白抗体对斑马鱼视网膜冰冻切片进行免疫荧光标记,发现1个月时,与野生型斑马鱼相比,USH2A-/-斑马鱼视网膜基底膜纤连蛋白荧光信号即出现减弱;随着年龄增长,到10个月左右,在USH2A-/-斑马鱼中荧光信号基本消失。免疫印迹检测纤连蛋白表达,同样发现USH2A-/-斑马鱼视网膜的纤连蛋白存在下调。此外,细胞粘附分子ITGB1的表达也下调,说明细胞与胞外基质之间的粘附作用可能减弱。这些结果表明在视网膜的基底膜,USH2A可能作为结构蛋白与纤连蛋白存在相互作用,调控着基底膜的粘附作用。另外,通过免疫印迹检测发现,USH2A-/-斑马鱼中USH1B蛋白和USH1C蛋白的表达上调。因USH蛋白在体内通常以复合体形式发挥作用,USH1蛋白的上调可能是由于USH2A蛋白缺失触发了某种未知的机制。这一方面的发现值得进一步的研究。综上所述,本论文首次构建了USH2A基因敲除的斑马鱼模型,利用该模型,我们成功模拟了USH2A患者的表型,包括听力损伤和进行性的视网膜色素变性。在该模型中探究USH2A的功能,发现USH2A缺失会导致视网膜基底膜纤连蛋白的装配异常,引起基底膜粘附作用减弱,提示这可能是USH2A突变导致视网膜色素变性的原因之一。我们的研究为揭示USH2A突变导致视网膜感光细胞退化的机制提供了基础,对后续的治疗研究具有重要意义。