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目的:研究维生素D对肺纤维化的影响及相关机制,为肺纤维化的防治提供新思路。方法:本研究主要包括三个部分:第一部分通过生长转化因子β(TGF-β)诱导细胞发生上皮间质转化(EMT)构建细胞纤维化模型,通过细胞形态学及Western blot检测相关蛋白的表达情况确定造模是否成功。第二部分主要研究1,25-(OH)2D3对TGF-β引起细胞上皮间质转化的影响。第一部分结果显示,分别以5 ng/ml和10 ng/ml TGF-β可以引起A549细胞和BEAS-2B细胞发生上皮间质转化。通过CCK-8和前期实验结果确定维生素D(1,25-(OH)2D3)的剂量分别为10 n M和50 n M。实验分为四组:空白对照组、TGF-β组、维生素D组、TGF-β和维生素D联合处理组。通过细胞划痕实验分析细胞的迁移能力,Transwell实验分析细胞的侵袭能力、流式细胞仪检测细胞的抗凋亡能力、免疫荧光了解E-cad、Vimentin、VDR表达位置和表达量的改变情况,Western blot检测E-cad、Vimentin、β-catenin、Snail、Slug、VDR的表达情况,RT-PCR检测纤维蛋白、I型胶原m RNA表达情况。第三部分,通过一次性腹腔注射百草枯构建小鼠肺纤维化模型,在造模的同时给予维生素D(1000 IU/周),观察维生素D对百草枯致肺纤维化的影响。通过体重变化,HE染色观察肺纤维化情况、羟脯氨酸检测试剂盒检测肺组织羟脯氨酸含量,Western blot检测肺组织E-cad、Vimentin、β-catenin、Snail、Slug、VDR、TGF-β、MCP-1的表达情况。结果:(1)5 ng/ml TGF-β可以使A549细胞形态发生改变,10 ng/ml TGF-β可以使BEAS-2B细胞形态发生改变,但TGF-β(10 ng/ml)不能够引起HBE细胞形态发生改变。通过Western blot检测结果发现TGF-β处理A549细胞和BEAS-2B细胞后,上皮细胞标志蛋白E-cad表达下降、间质细胞标志蛋白Vimentin、N-cad、EMT转录因子Snail、Wnt通路中关键蛋白β-catenin表达升高,并且随着处理时间增加形态学和相关蛋白表达改变越明显。但是,TGF-β不能引起HBE细胞形态学和EMT相关蛋白表达改变。因此,形态学和Western blot检测结果说明TGF-β诱导A549细胞和BEAS-2B细胞发生上皮间质转化,成功构建细胞纤维化模型。(2)TGF-β处理A549细胞后,细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞,细胞间连接消失,且时间越长形态学改变越明显。细胞划痕实验结果表明TGF-β促进A549细胞的迁移能力;TGF-β和1,25-(OH)2D3同时作用,1,25-(OH)2D3抑制TGF-β引起的细胞迁移能力增强。Transwell实验结果表明TGF-β促进A549细胞的侵袭能力;TGF-β和1,25-(OH)2D3同时作用,1,25-(OH)2D3抑制TGF-β引起的细胞侵袭能力增强。免疫荧光和Western Blot结果显示,TGF-β促进Vimentin、N-cad、β-catenin、VDR表达,抑制E-cad表达。维生素D单独作用促进E-cad、VDR表达,抑制Snail表达,对N-cad、Vimentin、β-catenin作用不明显。TGF-β和1,25-(OH)2D3联合作用时可以改善TGF-β引起的E-cad表达降低,Vimentin、N-cad、β-catenin、Snail表达的升高。因此,维生素D可以抑制TGF-β引起的A549细胞EMT,其机制可能是维生素D抑制了EMT过程中的转录因子Snail和Wnt通路中的关键蛋白β-catenin表达,使得E-cad表达升高,N-cad、Vimentin表达降低。(3)TGF-β处理BEAS-2B细胞后,细胞由卵圆形或多边形的上皮细胞变成长梭形的间质细胞,细胞间连接消失,且时间越长形态学改变越明显。当1,25-(OH)2D3和TGF-β联合作用时,细胞形态学改变有所缓解。Western Blot检测结果发现,TGF-β与1,25-(OH)2D3联合作用较TGF-β单独作用相比,EMT过程中转录因子Snail、Wnt通路中关键蛋白β-catenin表达下降,而上皮细胞标志蛋白E-cad、间质细胞标志蛋白Vimentin表达变化不明显。1,25-(OH)2D3单独作用时,与空白对照相比,上皮细胞标志蛋白E-cad表达升高、EMT过程中转录因子Snail表达降低,间质细胞标志蛋白Vimentin、Wnt通路关键蛋白β-catenin表达变化不明显。因此,维生素D可以抑制TGF-β引起的BEAS-2B细胞发生EMT。(4)一次性腹腔注射百草枯能够成功构建小鼠肺纤维化模型。通过预实验发现一次性腹腔注射10 mg/kg百草枯对肺损伤不明显;20 mg/kg百草枯腹腔注射可以引起肺组织充血、水肿及炎症细胞浸润;30 mg/kg百草枯腹腔注射可以引起肺组织出血、水肿、炎症细胞浸润、肺泡结构破坏、成纤维细胞增生、胶原蛋白沉积并且小鼠出现死亡。40 mg/kg百草枯腹腔注射可以引起肺组织出血、水肿、炎症细胞浸润及纤维化,在百草枯注射后的3-4天出现死亡(主要死因为肺出血),死亡率高。因此,我们选择一次性腹腔注射30 mg/kg百草枯构建小鼠肺纤维化模型。(5)一次性腹腔注射30 mg/kg百草枯构建小鼠肺纤维化模型,在造模前后每周给予1000 IU维生素D肌肉注射,时间为百草枯注射后的一个月。肺组织病理切片HE染色显示维生素D可以缓解百草枯导致肺纤维化。羟脯氨酸检测也发现与百草枯组相比,百草枯和维生素D联合作用组羟脯氨酸含量有所下降,说明维生素D对百草枯致肺纤维化过程有缓解或改善作用。结论:(1)TGF-β可以使A549细胞和BEAS-2B细胞发生上皮间质转化而构建细胞纤维化模型,但不能引起HBE细胞发生上皮间质转化。(2)1,25-(OH)2D3抑制TGF-β诱导A549细胞和BEAS-2B细胞EMT,其机制可能是1,25-(OH)2D3抑制EMT过程中转录因子Snail、Wnt通路中关键蛋白β-catenin的表达,使得间质细胞标志蛋白Vimentin、N-cad表达降低,上皮细胞标志蛋白E-cad表达升高。(3)一次性腹腔注射30 mg/kg百草枯可以构建小鼠肺纤维化模型,肺纤维化症状明显、致死率低。(4)维生素D对百草枯致肺纤维化有缓解或改善作用。