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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害全球养猪生产的重要病原,高致病性PRRSV的出现和流行给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV基因组可编码产生至少14个非结构蛋白,其中非结构蛋白4 (Nsp4)具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,在病毒的复制、抑制宿主天然免疫反应和诱导宿主细胞凋亡的过程中具有重要作用。本研究以PRRSV非结构蛋白Nsp4为研究对象,筛选与鉴定出与PRRSV Nsp4相互作用的猪肺泡巨噬细胞蛋白—细胞色素c1(Cytochrome c1,Cyto.c1),进一步研究了其相互作用及其影响Nsp4诱导细胞凋亡的分子机制,以期揭示Nsp4新的生物学功能,并为阐明PRRSV的分子致病机制提供科学依据。利用PRRSV高致病性毒株JXwn06,采用慢病毒包装技术,成功构建并拯救插入JXwn06 Nsp4基因及其酶活位点单点突变的重组慢病毒,并成功侵染MARC-145细胞,最终获得表达融合蛋白的Nsp4单点突变体传代细胞系。由于Nsp4可诱导细胞凋亡,未能获得Nsp4稳定表达的细胞系。为研究Nsp4诱导细胞凋亡的分子机制,以Nsp4作为“诱饵”蛋白,利用猪肺泡巨噬细胞cDNA文库和酵母双杂交技术,成功筛选获得与凋亡调控和凋亡信号传导相关蛋白—细胞色素c1(Cyto.c1),并通过酵母回交试验加以确认。利用免疫共沉淀技术(Co-IP)和激光共聚焦试验验证了 Nsp4和Cyto.c1在宿主细胞中相互作用,并确定其相互作用的区域分别为Nsp4的N端(1～160aa)和 Cyto.c1 的 N 端(1～230aa)。利用siRNA技术沉默MARC-145细胞中内源性Cyto.c1表达,分析Nsp4与Cyto.c1相互作用对Nsp4诱导细胞凋亡的影响。结果表明,干扰Cyto.c1表达后,Nsp4所诱导的细胞凋亡被显著抑制。同时,发现在PRRSV感染和质粒转染的情况下,Nsp4可以剪切Cyto.c1,剪切能力是由其3C样丝氨酸蛋白酶活性所决定的,并呈现剂量依赖性。进一步研究发现,Cyto.c1的E230aa～G231aa是决定Nsp4剪切活性的关键位点。Cyto.c1被剪切后形成的Cyto.c1/1～230aa蛋白可明显激活Caspase-3,同时引起线粒体的片段化,进而导致线粒体损伤,激活线粒体凋亡通路,最后诱导细胞凋亡的发生。综上所述,本研究筛选并鉴定出PRRSV Nsp4可与宿主细胞蛋白Cyto.c1相互作用,揭示了这一相互作用在Nsp4诱导宿主细胞凋亡中的分子机制,为阐明PRRSV的致病机理提供了有价值的科学依据。