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第一部分miR-23b对BMP9诱导间充质干细胞成骨的调控 目的:验证前期筛选出的microRNAs(miRNAs)在BMP9诱导间充质干细胞分化过程中存在的表达差异,同时探讨其功能。 方法:Ad-BMP9感染间充质干细胞系(C3H10),qPCR在不同时间点检测前期研究中筛选出的miRNAs。与此同时使用qPCR检测成骨特异性基因ALP等在第三天的表达。使用miR-23b模拟物对BMP9诱导C3H10和C2C12细胞成骨细胞模型进行干预,第七天和第十四天分别采用ALP染色和茜素红染色检测磷酸盐和钙盐沉积。体内实验中,首先使用Ad-BMP9感染C3H10细胞,再用miR-23b长效模拟物转染C3H10细胞,将细胞移植入4周左右裸鼠皮下,构建异位成骨模型。4周后,处死小鼠,取出皮下异位骨,microCT检测异位骨的骨体积和骨密度,骨组织脱钙,切片,进行HE染色和masson染色。 结果:qPCR检测 BMP9诱导 MSC成骨分化开始7天内 miR-23b,miR-155和miR-21的表达,miR-23b的表达在BMP9诱导的早期成骨中处于下调状态,第三天时达到表达最低点,对比第一天约下调了3倍;而另外两个miRNAs的表达都上调,miR-155和miR-21的表达在第五天时对比第一天分别上调约19倍和11倍。同时,qPCR结果也验证了在BMP9诱导的成骨分化过程中,ALP、Runx2、OCN和OPN的mRNA的表达升高。使用 miR-23b模拟物 mimics和 inhibitor外源性上调和沉默C3H10细胞和C2C12细胞中miR-23b的表达量,ALP染色和定量结果,以及茜素红染色结果表明miR-23b能通过抑制ALP活性和钙盐沉积抑制BMP9诱导MSC成骨分化的能力。体内实验,microCT扫描异位骨组织并3D重建计算骨体积和骨密度,miR-23b能够抑制BMP9诱导C3H10皮下成骨的体积而对骨密度没有显著性影响。骨组织的组织化学染色, HE染色和masson染色结果显示miR-23b能抑制异位骨的成熟度。 结论:通过芯片结果和qPCR结果互相验证,确定了miR-23b等在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的表达存在差异。体外和体内动物实验表明,miR-23b能够抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的能力,并能够抑制骨的体积的分化成熟,影响体内成骨。 第二部分miR-23b调控BMP9诱导间充质干细胞成骨分化靶基因的寻找和验证 目的:生物信息学方法寻找miR-23b在调控BMP9诱导MSC成骨分化过程中的靶基因并进行验证。 方法:通过生物信息学数据库TargetScan,PicTar,和miRbase进行联合检索,寻找miR-23b可能的靶基因。qPCR和免疫印迹法(Western blot,WB)验证在miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中靶基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。设计构建双荧光素酶报告质粒,检测miR-23b与靶基因3’-UTR区域的结合能力。干扰miR-23b靶基因Runx2的表达,检测miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中成骨特异基因ALP等的表达。 结果:检索不同数据库,交叉分析,预测到Runx2,PTEN,和SATB2基因可能是miR-23b的靶基因。qPCR结果表明,miR-23b对它们mRNA水平的表达没有显著性影响,但是能够抑制它们蛋白水平的表达。双荧光素酶报告载体实验证实,miR-23b能通过与它们的3’-UTR区域靶向结合,降低荧光素酶活性。在miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中,通过干扰Runx2,ALP和OCN等成骨基因表达下调,同时早期成骨标志物ALP活性降低。 结论:Runx2,PTEN和SATB2是miR-23b调控BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的靶基因,其中Runx2是miR-23b发挥调控作用的重要的靶基因。 第三部分甲基化对BMP9诱导间充质干细胞成骨的影响 目的:分析甲基化作用对 BMP9诱导间充质干细胞成骨的影响,以及对miRNAs表达的影响。 方法:使用去甲基化的药物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5az)处理BMP9诱导C3H10和C2C12成骨分化模型,首先筛选5az作用细胞的最佳浓度;使用该浓度处理细胞后五天,qPCR检测成骨特异性基因 Runx2等的mRNA水平和miRNAs的表达,同时对早期成骨标志物ALP进行检测。 结果:通过ALP染色和定量结果表明5az在10mM终浓度时,能够较好的促进 BMP9诱导 MSC成骨分化同时损伤细胞。qPCR检测MSC中各成骨特异性基因的表达发现,5az能上调BMP9诱导成骨分化过程中ATF4,Runx2,OCN,OPN的表达,均有3~4倍的上调;5az能促进miRNAs的表达,miR-23b表达上调3.8倍,miR-21上调2.4倍,miR-155上调4.5倍。ALP染色结果显示,去甲基化作用能够促进磷酸盐的沉积。 结论:甲基化调控能够直接通过促进成骨基因的表达来促进BMP9诱导MSC成骨分化,同时也能促进miRNA的表达,间接影响该过程。