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第一部分miR-23b对BMP9诱导间充质干细胞成骨的调控 目的：验证前期筛选出的microRNAs（miRNAs）在BMP9诱导间充质干细胞分化过程中存在的表达差异，同时探讨其功能。 方法：Ad-BMP9感染间充质干细胞系（C3H10），qPCR在不同时间点检测前期研究中筛选出的miRNAs。与此同时使用qPCR检测成骨特异性基因ALP等在第三天的表达。使用miR-23b模拟物对BMP9诱导C3H10和C2C12细胞成骨细胞模型进行干预，第七天和第十四天分别采用ALP染色和茜素红染色检测磷酸盐和钙盐沉积。体内实验中，首先使用Ad-BMP9感染C3H10细胞，再用miR-23b长效模拟物转染C3H10细胞，将细胞移植入4周左右裸鼠皮下，构建异位成骨模型。4周后，处死小鼠，取出皮下异位骨，microCT检测异位骨的骨体积和骨密度，骨组织脱钙，切片，进行HE染色和masson染色。 结果：qPCR检测 BMP9诱导 MSC成骨分化开始7天内 miR-23b，miR-155和miR-21的表达，miR-23b的表达在BMP9诱导的早期成骨中处于下调状态，第三天时达到表达最低点，对比第一天约下调了3倍；而另外两个miRNAs的表达都上调，miR-155和miR-21的表达在第五天时对比第一天分别上调约19倍和11倍。同时，qPCR结果也验证了在BMP9诱导的成骨分化过程中，ALP、Runx2、OCN和OPN的mRNA的表达升高。使用 miR-23b模拟物 mimics和 inhibitor外源性上调和沉默C3H10细胞和C2C12细胞中miR-23b的表达量，ALP染色和定量结果，以及茜素红染色结果表明miR-23b能通过抑制ALP活性和钙盐沉积抑制BMP9诱导MSC成骨分化的能力。体内实验，microCT扫描异位骨组织并3D重建计算骨体积和骨密度，miR-23b能够抑制BMP9诱导C3H10皮下成骨的体积而对骨密度没有显著性影响。骨组织的组织化学染色， HE染色和masson染色结果显示miR-23b能抑制异位骨的成熟度。 结论：通过芯片结果和qPCR结果互相验证，确定了miR-23b等在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的表达存在差异。体外和体内动物实验表明，miR-23b能够抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的能力，并能够抑制骨的体积的分化成熟，影响体内成骨。 第二部分miR-23b调控BMP9诱导间充质干细胞成骨分化靶基因的寻找和验证 目的：生物信息学方法寻找miR-23b在调控BMP9诱导MSC成骨分化过程中的靶基因并进行验证。 方法：通过生物信息学数据库TargetScan，PicTar，和miRbase进行联合检索，寻找miR-23b可能的靶基因。qPCR和免疫印迹法（Western blot，WB）验证在miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中靶基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。设计构建双荧光素酶报告质粒，检测miR-23b与靶基因3’-UTR区域的结合能力。干扰miR-23b靶基因Runx2的表达，检测miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中成骨特异基因ALP等的表达。 结果：检索不同数据库，交叉分析，预测到Runx2，PTEN，和SATB2基因可能是miR-23b的靶基因。qPCR结果表明，miR-23b对它们mRNA水平的表达没有显著性影响，但是能够抑制它们蛋白水平的表达。双荧光素酶报告载体实验证实，miR-23b能通过与它们的3’-UTR区域靶向结合，降低荧光素酶活性。在miR-23b调控BMP9诱导MSC成骨分化模型中，通过干扰Runx2，ALP和OCN等成骨基因表达下调，同时早期成骨标志物ALP活性降低。 结论：Runx2，PTEN和SATB2是miR-23b调控BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的靶基因，其中Runx2是miR-23b发挥调控作用的重要的靶基因。 第三部分甲基化对BMP9诱导间充质干细胞成骨的影响 目的：分析甲基化作用对 BMP9诱导间充质干细胞成骨的影响，以及对miRNAs表达的影响。 方法：使用去甲基化的药物5-氮杂-2-脱氧胞苷（5az）处理BMP9诱导C3H10和C2C12成骨分化模型，首先筛选5az作用细胞的最佳浓度；使用该浓度处理细胞后五天，qPCR检测成骨特异性基因 Runx2等的mRNA水平和miRNAs的表达，同时对早期成骨标志物ALP进行检测。 结果：通过ALP染色和定量结果表明5az在10mM终浓度时，能够较好的促进 BMP9诱导 MSC成骨分化同时损伤细胞。qPCR检测MSC中各成骨特异性基因的表达发现，5az能上调BMP9诱导成骨分化过程中ATF4，Runx2，OCN，OPN的表达，均有3～4倍的上调；5az能促进miRNAs的表达，miR-23b表达上调3.8倍，miR-21上调2.4倍，miR-155上调4.5倍。ALP染色结果显示，去甲基化作用能够促进磷酸盐的沉积。 结论：甲基化调控能够直接通过促进成骨基因的表达来促进BMP9诱导MSC成骨分化，同时也能促进miRNA的表达，间接影响该过程。