结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是结核病的病原体,全球约1/3人口携带此菌。近年来,多重耐药甚至广泛耐药结核分枝杆菌菌株的出现使现有的抗结核药物已经不能满足治疗结核病和控制疾病蔓延的要求。因此,寻找新的抗结核药物作用靶点是当前迫在眉睫的研究任务。结核分枝杆菌具有独特的细胞壁结构,使其能够抵抗环境的不利因素。其细胞壁的核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成,其中肽聚糖是维持分枝杆菌细胞形态和菌体渗透压平衡的结构基础。肽聚糖由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替形成骨架结构,并与多肽相连接,形成网状结构。UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)和UDP-N-乙酰胞壁酸(UDP-MurNAc)分别是N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁的糖基供体,而UDP-MurNAc是由UDP-GlcNAc经两步酶促反应生成。UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶(MurA)催化其第一步反应,将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的烯醇丙酮基团转移到UDP-GlcNAc的3’羟基,生成UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸。MurA已被证明为结核分枝杆菌生长必需基因,并且在哺乳动物细胞中并不存在N-乙酰胞壁酸代谢途径及MurA酶,因此,MurA是理想的抗结核药物作用靶点。多个物种(E.coli,H.influenzae等)MurA酶的催化性质和结构特征已有深入研究,但尚无关于结核分枝杆菌MurA酶促反应动力学特征和3D结构的报道。研究结核分枝杆菌MurA酶的最大难点在于其可溶性极低,在大肠杆菌中诱导表达通常以无活性的包涵体的形式存在。在本课题的研究中,我们引入了一种带有冷休克基因cspA启动子的pColdⅡ表达系统,低温下诱导表达MurA蛋白,大大提高了蛋白的可溶性。我们纯化了 MurA蛋白并获得了其酶促反应动力学参数。结核分枝杆菌具有致病性和传染性,并且菌体代谢缓慢,因此不利于直接研究MurA沉默表达对结核分枝杆菌的影响。我们选取了与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构并且生长快速、无致病性的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smemgmatis)作为实验模式菌,应用受四环素诱导的pMind载体,构建了murA反义RNA条件性表达菌株,下调MurA蛋白的表达,并进一步研究MurA的低表达对分枝杆菌的影响。本论文的研究目的:1.获得结核分枝杆菌MurA纯化蛋白,建立UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性鉴定方法,分析MurA酶促反应动力学特征,从海洋放线菌此生代谢物组分库中初步筛选MurA酶抑制剂;2.利用反义RNA技术构建耻垢分枝杆菌条件性murA基因敲减菌株,研究MurA表达下调对分枝杆菌生长、形态、结构、药物敏感性和蛋白质组学的影响;3.构建受乙酰胺诱导的pVVAP表达系统,为MurA的功能分析提供新的研究工具。研究结果:1.结核分枝杆菌MurA蛋白的可溶性表达、酶促反应动力学分析和酶抑制剂筛选1.1获得了可溶性MurA蛋白将pCold-Mtb 表达质粒转化至E.coli BL21菌株中,用终浓度0.4 mM IPTG于16℃诱导MurA蛋白的表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化携带C-末端组氨酸标签的MurA蛋白,并通过超滤离心除去小分子物质。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,我们获得了纯度和浓度都非常理想的可溶性MurA蛋白。1.2建立了 MurA酶活性分析方法通过HPLC技术检测MurA酶促反应前后底物UDP-GlcNAc的减少量,以鉴定MurA纯化蛋白的酶活性。结果显示,经MurA酶催化,UDP-GlcNAc的含量降低了 60.1%,证明纯化的MurA蛋白具有UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性。为了便于对MurA酶进行酶促反应动力学分析和高通量抑制剂筛选,我们建立了 MurA酶活性简便、快速、准确的检测方法——孔雀石绿显色法,通过检测反应中生成的无机磷酸定量分析MurA酶活性。孔雀石绿显色结果进一步验证了纯化的MurA蛋白的酶活性,经计算,MurA酶的比活性为0.305±0.006 uM min-1μg-1。1.3确定了 MurA酶促反应动力学参数利用建立的孔雀石绿显色法测定MurA酶促反应动力学参数。结果显示,MurA酶促反应初速度范围是酶浓度不大于10 Mg/ml,反应时间不超过15 min;在初速度范围内,我们测定出MurA酶的最适作用温度为37℃,最适pH值为pH 7.5,酶活性不依赖于Ca2+,Mg2+等金属离子;MurA酶对底物UDP-GlcNAc的Km值为2.743±0.231 mM,Vmax 值为 0.430±0.027 μM min-1;MurA 酶对底物 PEP 的 Km值为0.199± 0.013 mM,Vmax 值为 0.767±0.003 μM min-1。1.4 MurA酶抑制剂筛选将海洋放线菌次生代谢物组分库中60种组分分别以50 μg/ml终浓度加入到酶促反应体系中,利用建立的孔雀石绿显色法初步筛选抑制MurA酶活性的组分。结果显示6种组分对MurA酶活性有明显的抑制作用,使MurA酶活性降低60%以上。2.耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达系统的构建及MurA蛋白下调表达对耻垢分枝杆菌的影响2.1构建了耻垢分枝杆菌murA反义RNA表达系统获得耻垢分枝杆菌murA基因5’端DNA片段,反向插入受四环素诱导的pMind表达载体,并转化至耻垢分枝杆菌,获得murA反义RNA表达菌株,即MurA蛋白条件性下调表达菌株。2.2制备了耻垢分枝杆菌MurA蛋白多克隆抗体将纯化的耻垢分枝杆菌MurA蛋白免疫BalB/c小鼠,获得抗MurA多克隆抗体。Elisa和Western blot检测结果显示,制备的抗体具有理想的效价和特异性,可用于检测murA基因敲减菌株中MurA蛋白的表达情况。2.3确定了 pMind系统诱导反义RNA,下调MurA蛋白表达的最佳条件用不同浓度四环素诱导murA反义RNA的表达,根据分枝杆菌的生长情况确定了 pMind表达系统的最佳条件。用20 ng/ml四环素诱导36 h,可有效下调murA反义RNA表达菌株中MurA蛋白的表达,抑制细菌生长。2.4探讨了 MurA下调表达对分枝杆菌细胞形态和结构、药物敏感性和蛋白质组学的影响分别利用扫描电镜和透射电镜观察murA反义RNA表达菌株在20 ng/ml四环素诱导后发生的形态学和细胞结构的变化。结果显示,在MurA表达下调后,耻垢分枝杆菌细胞发生肿胀,细胞壁结构破坏,内容物渗出,细胞间发生融合。利用AlamarBlue法分析MurA下调表达菌株对异烟肼、乙胺丁醇的最小抑制浓度变化。结果显示,MurA的低表达并不改变耻垢分枝杆菌对以上两种药物的敏感性。利用双向电泳技术研究MurA下调表达引起的耻垢分枝杆菌蛋白质组学变化。结果显示,MurA蛋白的低表达引起耻垢分枝杆菌多个蛋白表达水平的变化,经MOLDI-TOF质谱分析,我们最终选取5个差异蛋白,包括2个下调表达的蛋白和3个上调表达的蛋白进行后续研究。3.分枝杆菌乙酰胺诱导表达载体pVVAP的构建及其在条件性反义RNA表达系统中的应用3.1构建了受乙酰胺诱导的pVVAP表达载体以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,获取乙酰胺酶启动子DNA片段,连接到pVV16质粒的XbaI和NdeI位点,替换pVV16的Phsp60启动子,构建成pVVAP表达载体。3.2验证了pVVAP系统诱导表达反义RNA的效果以耻垢分枝杆菌glmM基因作为研究模型,将glmM 5’端DNA片段反向插入pVVAP载体,并转化至耻垢分枝杆菌,通过分枝杆菌的生长及GlmM蛋白的表达水平确定反义RNA表达效果。结果显示,用1.5%(w/v)乙酰胺诱导72 h可有效下调GlmM蛋白的表达,并抑制glmM反义RNA表达菌株的生长,表明构建的pVVAP表达载体可用于下调目标蛋白的表达,是构建分枝杆菌基因敲减菌株的理想载体。结论:1.利用pColdⅡ表达载体在E.coli BL21菌株中稳定表达了可溶性MurA蛋白,纯化后的MurA蛋白具有UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮转移酶活性。2.建立了 MurA酶活性的孔雀石绿显色检测方法,确定了 MurA酶促反应动力学参数,并从海洋放线菌次生代谢物组分库中初步筛选了 MurA酶抑制剂。3.MurA的下调表达导致分枝杆菌生长缓慢,细胞形态、结构和蛋白质组发生变化。4.构建了分枝杆菌受乙酰胺诱导的pVVAP表达载体,为MurA及其它蛋白的功能研究提供了新的分子生物学工具。未来研究方向:1.利用建立的MurA酶活性显色方法,继续筛选抑制MurA酶活性的组分和化合物,根据MurA酶促反应动力学参数确定抑制剂的类型,并通过晶体结构分析阐明抑制剂的作用机制。2.研究MurA下调表达后分枝杆菌对其它抗结核药物(利福平、吡嗪酰胺、链霉素等)敏感性的影响,为联合用药治疗结核病提供可能。3.利用Real-time RCR技术对MurA下调表达引起的蛋白差异点进行验证,绘制蛋白质相互作用网络,以期发现与MurA蛋白相关的药物作用的新靶点。4.将pVVAP表达系统应用于MurA功能分析中,研究MurA下调表达对耻垢分枝杆菌生物膜形成的影响。