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背景:肝脏缺血再灌注损伤(IRI)是肝损伤的重要原因,它会引起细胞凋亡反应并导致细胞功能障碍。Bach1是哺乳动物的转录因子,它抑制Hmox1的生成,而Hmox1可以编码血红素加氧酶-1(HO-1),HO-1在IRI中可起到抗凋亡、抗炎等多种保护作用。miR-27a-5p表达于多种细胞,它现已被证明可靶向作用于多种凋亡相关基因。然而,miR-27a-5p是否能够在肝脏缺血再灌注损伤中调控Bach1-HO-1通路并起到凋亡调节作用目前尚不清楚。此为本研究的主要内容。目的:采用双荧光素酶报告系统来验证Bach1是否为miR-27a-5p的靶基因,探讨miR-27a-5p-Bach1通路是否参与小鼠肝脏缺血再灌注损伤,并在体外建立细胞缺氧/复氧(H/R)模型以模拟体内肝脏缺血再灌注损伤,并通过转染mimic/inhibitor miR-27a-5p以及Bach1 siRNA来进一步探讨其抗凋亡作用机制。方法:1.体内实验1)建立小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,热缺血时间为1h,再灌注时间点分别选取0h,12h。2)采用HE染色方法观察检测肝细胞损伤情况。3)采用免疫组化检测caspase-3阳性表达水平。4)采用Tunel法检测各组肝细胞凋亡情况。5)采用Western blot检测组织中Bach1、HO-1蛋白表达水平。6)采用RT-qPCR方法检测不同时间点miR-27a-5p的表达变化。2.体外实验1)采用双荧光素酶报告系统来检测miR-27a-5p是否与Bach1的3’-UTR区域结合从而靶向调控Bach1。2)在小鼠肝AML12细胞中建立缺氧/复氧模型,缺氧时间为1h,复氧时间点分别选取0h,12h。3)采用RT-qPCR法检测细胞模型中不同时间点miR-27a-5p的表达变化。4)在细胞模型中分别转染miR-27a-5p mimic,inhibitor及Bach1 siRNA。5)采用Western blot检测细胞中Bach1、HO-1、Bcl2、caspase-3蛋白表达。6)采用Annexin V-FITC法,选取复氧12h时间点比较不同转染组间细胞凋亡水平的变化。结果:1.通过targetscan网站查询发现miR-27a-5p与Bach1基因的3’-UTR区域有两个可能的结合位点,并通过双荧光素酶报告系统检测发现miR-27a-5p显著降低Bach1的3’-UTR区的荧光素酶活性。2.在体内实验小鼠肝脏损伤方面,光镜下HE染色中缺血再灌注组的肝窦淤血明显,肝小叶结构紊乱,炎性细胞浸润增多,细胞部分成气球样变甚至嗜酸性坏死,Tunel法检测细胞凋亡数增多,免疫组化检测caspase-3也为相似结果。3.在小鼠肝脏缺血再灌注损伤中,miR-27a-5p的表达水平在热缺血以及再灌注阶段都增加,并且在再灌注组中,HO-1蛋白表达量最高,而Bach1的表达水平在此时最少。4.小鼠肝AML12细胞缺氧/复氧模型中转染miR-27a-5p mimic使mi R-27a-5p过表达后,通过Western blot检测,与对照组相比,Bach1表达减少,HO-1表达增加,抗凋亡基因bcl-2蛋白水平增加,促凋亡基因caspase-3表达减少(P<0.05),转染miR-27a-5p inhibitor,下调miR-27a-5p后得到相反结果(P<0.05),同时,转染Bach1 siRNA后与对照组相比HO-1、Bcl-2表达水平增加(P<0.05),Caspase-3蛋白水平下降(P<0.05),差异具有统计学意义。5.选取选取复氧12h时间点,采用RT-qPCR发现过表达mi R-27a-5p及转染Bach1 siRNA后,与对照组相比,Bach1表达减少(P<0.05),HO-1 mRNA表达增多(P<0.05),而转染inhibitor mi R-27a-5p下调miR-27a-5p后得到相反结果。6.选取复氧12h时间点检测细胞凋亡率,与对照组相比,转染miR-27a-5p mimic和Bach1 siRNA后使细胞凋亡率下降(P<0.05),转染miR-27a-5p inhibitor后细胞凋亡率增加(P<0.05)。结论:1.通过双荧光素酶报告系统检测发现miR-27a-5p可靶向作用于Bach1。2.miR-27a-5p及其调控通路Bach1-HO-1参与小鼠肝脏缺血再灌注损伤过程。3.本研究提示过表达miR-27a-5p可在缺氧/复氧中产生一定的抗凋亡作用。