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研究背景:血管内皮是一层选择性透过的屏障,控制着血浆成分渗透以及细胞穿越。内皮细胞与细胞之间的连接在维持和调控血管完整性中发挥关键作用,其中尤以黏连连接最为重要。黏连连接中的VE-cadherin(血管内皮钙粘蛋白)在胞内的转运对于血管发育、内皮完整性和血管的稳态非常重要。VE-cadherin在细胞膜上的稳定性受可逆磷酸化的调控。SHP2(Src同源酪氨酸磷酸酶2)是一个胞内广泛表达的非受体型酪氨酸磷酸酶。体外研究表明SHP2参与调控内皮屏障,但是其在体内的生理学机制依然不清楚。研究目的及方法:为了探究SHP2调控内皮屏障的分子机制,利用SHP2干扰慢病毒敲降内皮细胞中SHP2,然后通过免疫荧光、免疫印迹、免疫共沉淀、血管通透性实验以及生物素标记实验等方法研究内皮中SHP2对VE-cadherin的膜定位和VE-cadherin复合物稳定性的影响。同时利用shp2内皮特异敲除小鼠作为模型,用石蜡切片HE染色(苏木素-伊红染色)、免疫荧光染色、整体包埋免疫组化染色、X-gal染色、透射电镜等方法研究SHP2的生理学机制。实验结果:在人脐带静脉内皮细胞中敲降SHP2或者抑制SHP2的酶活性会破坏VE-cadherin在黏连连接的定位,同时增加内皮通透性。SHP2缺失会导致ARF1(二磷酸腺苷核糖基化因子1)激活,激活的ARF1促进VE-cadherin内化。ARF1敲降和ARF1的激活抑制剂SecinH3均能显著降低SHP2缺失导致的VE-cadherin的内化。SHP2敲降导致MET(肝细胞生长因子受体)蛋白水平和磷酸化水平升高。敲降MET或者MET的抑制剂均能显著降低SHP2缺失导致的ARF1的激活和VE-cadherin的内化。说明MET激活对于SHP2敲降诱导的ARF1的激活和VE-cadherin的内化是必需的。此外内皮SHP2缺失小鼠出现胚胎弥漫性漏血和黏连连接处不规则的VE-cadherin定位。ARF1和MET抑制剂均能阻止SHP2内皮缺失导致的小鼠胚胎漏血,延长SHP2缺失小鼠的存活时间。结论:1.SHP2缺失导致内皮通透性升高。2.SHP2缺失导致VE-cadherin内化。3.ARF1介导SHP2缺失诱导的内皮屏障破坏。4.MET介导SHP2缺失诱导的ARF1的激活。5.Shp 内皮缺失小鼠胚胎弥漫性漏血,内皮连接破坏,同时VE-cadherin在膜上不连续分布。6.ARF1和MET的抑制剂均能挽救Shp2内皮缺失导致的胚胎漏血表型,同时延长Shp2内皮敲除胎鼠的存活时间。