肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)催化松柏醛生成松柏醇,是华细辛主要药理活性成分甲基丁香酚生物合成途径中的关键酶之一。分离CAD基因并进行功能验证是调控华细辛甲基丁香酚生物合成的基础工作。本研究通过转录组测序数据库筛选到华细辛7个可能的CAD基因转录本(AsGAD1～7),同时通过同源克隆获得1个华细辛CAD基因(AsCAD);对上述8个基因进行了生物信息学分析并构建了系统发育树,初步预测了华细辛CAD基因家族成员的特征;利用实时荧光定量PCR筛选出华细辛在不同生长时期及不同组织中进行基因表达定量分析时适宜的内参基因18SrRNA,在此基础上,进行AsCADs差异表达分析;利用Gateway技术构建AsCAD基因过表达载体pK7FWG2.0-AsGAD,通过浸花法转化拟南芥,检测木质素含量,验证基因功能。主要研究结果如下:(1)基于转录组测序数据库筛选出7个可能的华细辛GAD家族成员,分别命名为AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陆号分别为KY446440～KY446446。利用生物信息学相关分析软件对AsCADs所编码蛋白的一级、二级、三级结构以及功能进行分析,结果表明,AsCAD1～7分子量在30 kD～40 kD之间,属于酸性不稳定亲水蛋白质,无跨膜结构和信号肽,且空间结构较保守,具有Zin1、Zin2和NADPH结构域,属于MDR超家族成员。(2)基于同源克隆的原理和方法,利用PCR和RACE扩增技术,分离得到1个华细辛CAD cDNA全长,共1357 bp,命名为AsCAD(GenBank登陆号为KT454711)。生物信息学分析结果表明,AsGAD属于CAD家族成员,与AsCAD2基因序列一致性达到96.14%,推测是具有功能的候选基因。(3)利用实时荧光定量PCR以及分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等,从 SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP-2、GAPDH和TUB 6个候选内参基因中筛选华细辛在不同生长时期(营养生长期、花期、花后期)及不同组织中(根、根茎、叶片、叶柄、花)表达稳定的内参基因,结果表明18SrRNA在各个时期表达均比较稳定,是进行华细辛基因差异表达分析适宜的内参基因。(4)利用实时荧光定量PCR相对定量法,对AsCADs进行差异表达分析,结果表明,在华细辛生长发育过程中,AsCADs在根、根茎、叶片、叶柄和花中均有表达,但表达量不同,AsCAD3与AsCAD6表达量都相对较少。总体上,同一组织中,基因表达量呈现出营养生长期<花期<花后期的趋势。同一时期中,AsCAD1与AsCAD的表达模式相一致,均为地下部分(根与根茎)表达量高于地上部分(叶片与叶柄)表达量,AsCAD2与AsCADA在各组织的表达量差异较大,AsGAD5在根中的表达量最高,在叶片中的表达量最低,AsGAD7在各组织表达无明显差异,AsCAD在各组织表达水平均比较高。A5CADs表达水平的差异暗示基因功能的多样性。(5)利用Gateway技术构建AsCAD过表达载体pK7FWG2.0-AsCAD,通过农杆菌介导转化野生型拟南芥。抗性筛选以及PCR检测结果表明,成功获得了AsCAD过表达转基因拟南芥的阳性转化株。木质素含量测定结果进一步显示,转基因植株主茎木质素含量较野生型植株提高了 2.96%,增幅达到32.74%,整株植物木质素含量提高了 3.20%,增幅达到38.60%,说明AsCAD参与了植物木质素的生物合成,具有酶活性。本研究从华细辛中挖掘得到AsCADs,对其进行了差异表达分析和功能验证,为下阶段转化拟南芥进行RNAi抑制表达、转化华细辛进行同源表达,以及阐明甲基丁香酚生物合成分子调控机制奠定了工作基础。