【背景】肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)为原发性肝癌的一种临床分型，是我国常见的恶性肿瘤之一，且发病率逐年上升，其死亡率在恶性肿瘤中仅次于胃、食道居第三位。近年来HCC的诊断和治疗取得到了一定的发展，但预后仍然较差，阐明HCC的发生、发展机理，寻找新的、有效的杀伤HCC细胞方法是解决HCC诊治的根本途径。Tg737基因是新近发现的一种HCC抑癌基因，最初进行研究时发现其与常染色体隐性遗传性多囊肾病（autosomal recessive polycystic kidney disease, ARPKD）orpk鼠突变模型研究中的目的基因相同。该基因编码824个氨基酸的多肽序列，该多肽链中包含有十个串行排列的三十四肽重复基序（tetratricopeptide repeat，TPR）。虽然Tg737基因已证实在肿瘤形成中起着重要作用，包括肝脏、肾脏、胰腺，但是针对其在HCC发病过程中如何发挥作用的研究仍处于起步阶段。对Tg737基因的生物学功能的深入研究将为HCC开辟新的研究领域，阐明HCC分子调控网络，为寻找新的HCC的防治靶点奠定基础。【目的】为更好验证Tg737在胎肝干/祖细胞（fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs）恶性转化中的作用机制，本课题首先完善了分化方案，进行脱细胞化肝脏生物衍生支架动态培养（dynamic cultured scaffold，DCS）诱导骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）、FLSPCs向肝样细胞分化的研究，进而将所建立的诱导分化方案用于下步相关研究；研究Tg737信号通路在HCC发生、发展中的作用，为HCC的防治提供新的理论依据及干预靶点。【方法】1.构建大鼠脱细胞肝支架；将富集的BMSCs、FLSPCs经鉴定后分别分为两组，一组接种于支架上，添加肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）进行DCS，另一组加HGF贴壁培养；指定时间点western blot检测甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、白蛋白（albumin，ALB）、叉头框蛋白A1（forkhead box protein A1，FOXA1）、肝细胞核因子4α（hepatic nuclear factor4alpha，HNF4α），细胞色素氧化酶CYP1A2（cytochrome P4501A2，CYP1A2）的表达差异。2.利用shRNA慢病毒技术对抑制FLSPCs中Tg737的表达，在嘌呤霉素压力下培养，得到稳定转染细胞克隆Tg737抑制FLSPCs（Tg737-silent FLSPCs，sFLSPCs）；利用PCGC再次纯化正常FLSPCs（normal FLSPCs，nFLSPCs）、sFLSPCs，并通过流式细胞检测分析纯化后两组细胞CD133的表达，确保用于下步实验细胞的干细胞特性；通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、western blot、免疫荧光技术检测两组细胞Tg737RNA和蛋白水平。通过细胞计数、噻唑蓝（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法绘制nFLSPCs、sFLSPCs生长曲线；流式细胞技术检测细胞的增殖变化（包括增殖核抗原Ki67的表达、细胞周期和细胞凋亡）；HGF诱导分化后，通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在指定时间点检测细胞ALB和AFP表达变化，诱导分化后透射电镜观察Tg737抑制前后细胞的超微结构变化；进一步采用DCS+HGF诱导两组细胞分化，培养7天后收集两组细胞，western blot检测AFP、ALB、FOXA1、HNF4α、CYP1A2的表达差异；Transwell技术检测细胞的侵袭能力变化；裸鼠皮下成瘤实验，观察Tg737抑制前后细胞成瘤能力变化，以及细胞对动物肝脏的损害情况。Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B表达，验证细胞周期蛋白是否参加了Tg737调控FLSPCs增殖的变化；利用western blot技术检测Tg737抑制后，HNF4α表达的变化；利用激光共聚焦技术检测了Tg737与HNF4α在细胞内的定位情况，验证Tg737抑制导致FLSPCs分化受阻现象的可能分子机制是HNF4α作为Tg737的下游分子伴侣。3.含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的达氏修正依氏培养基（Dulbecco’sModified Eagle Medium，DMEM）常规培养HepG2和MHCC97-H细胞。除特别指出，以下实验均用含1%FBS的DMEM处理细胞。用浓度1％的氧处理细胞达指定时间建立低氧模型。采用Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）流式检测法排出1%FBS、低氧对细胞凋亡的影响；用浓度为1％的氧分别处理细胞（1%FBS）达指定时间，以常氧培养细胞（1%FBS）为对照组，检测细胞黏附、侵袭、转移力。Western blot检测10%FBS常氧组、1%FBS常氧组、1%FBS低氧组Tg737表达的变化。pcDNA3.1-Tg737经脂质体瞬时转染HepG2、MHCC97-H，转染pcDNA3.1()组、脂质体孵育组、空白组为对照；转染6h后，在缺氧条件下检测Tg737表达上调对细胞黏附、侵袭、转移力的影响；Annexin V/PI排出凋亡对实验的影响。Western blot检测10%FBS常氧组、1%FBS常氧组、1%FBS低氧组polycystin-1表达的变化；ELISA检测polycystin-1,白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）分泌的变化；在缺氧条件下检测Tg737表达上调对polycystin-1表达/分泌，IL-8、TGF-β1分泌的影响。【结果】1.富集的BMSCs纯度较高，细胞活力较好，高表达干细胞表面标志物CD44，而低表达造血干细胞（haematopoietic stem cells，HSCs）表面标志物CD45。富集的FLSPCs个头较小，核/浆比较大，高表达干细胞标志CD133和CD49f，低表达成熟肝细胞标志，能分化为表达ALB的类成熟肝细胞。在两组均添加生长因子的条件下，与二维贴壁培养比，DCS可更好的诱导BMSCs向肝样细胞分化，体现在诱导后的细胞高表达内胚层和肝细胞相关基因和蛋白，超微结构与功能更贴近肝细胞；体内实验证实DCS+生长因子诱导后的BMSCs对肝衰竭有更好的治疗效果。同样，DCS+HGF培养较贴壁+HGF培养更好的诱导FLSPCs向肝样细胞分化。该方案可用于下步相关研究。2.新纯化的nFLSPCs、sFLSPCs在形态学上无明显区别；在培养过程中，新纯化的sFLSPCs与nFLSPCs相比在第1天均高表达CD133，无统计学差别，随时间延长，两组细胞CD133表达均下降，nFLSPCs组下降更明显，在7d、14d sFLSPCs中CD133的表达均高于nFLSPCs； PCR、western blot、免疫荧光技术检测Tg737的mRNA与蛋白表达水平，抑制效果得到确认。排出了凋亡因素的影响后，我们发现由于Tg737的抑制通过促进细胞周期过程使细胞增殖速度明显加快；HGF诱导分化后，通过ELISA、透射电镜证实Tg737的抑制导致细胞分化受阻，DCS+HGF方案亦证实分化受阻；Transwell侵袭实验证实sFLSPCs获取了较强的侵袭能力；裸鼠成瘤实验显示Tg737抑制后sFLSPCs虽然在皮下未形成明显肿瘤，但是对肝脏造成了损伤、甚至形成了肿瘤。进一步分子机制的研究证实：shRNA抑制Tg737后，cyclinD1和cyclin B表达显著上升；HNF4α随着Tg737的抑制表达而极度下调，Tg737和HNF4α在细胞内具有共表达的趋势。3.低血清浓度、低氧条件对HepG2和MHCC97-H的活性无影响；与对照组相比，低氧减弱了肝癌细胞黏附力、增强了细胞侵袭、转移力。随着低氧模型的建立，HepG2和MHCC97-H中Tg737表达降低，而低血清浓度对Tg737的表达并无影响；western blot发现pcDNA3.1-Tg737转染并经低氧处理后，与对照组相比，pcDNA3.1-Tg737转染组中Tg737的表达明显上调；进一步发现由缺氧造成的肝癌细胞黏附、侵袭和转移力改变也随低氧下上调Tg737表达而减弱；与对照组相比，低氧诱导可下调HepG2和MHCC97-H polycystin-1的表达/分泌，上调IL-8的分泌，同时上调总TGF-β1、活化TGF-β1水平，而低血清浓度对以上分子的表达并无影响；随着在缺氧条件下上调Tg737的表达，polycystin-1的表达/分泌上调、IL-8的分泌、总TGF-β1、活化TGF-β1水平也相应下调；细胞活性因素、空载体、脂质体均对实验结果无影响。【结论】1.成功建立了DCS诱导分化方案，改方案能更好的诱导BMSCs、FLSPCs向肝样细胞分化，可用于FLSPCs的相关研究。2. Tg737的抑制表达能够促进FLSPCs发生恶性转化，该恶性转化过程可能通过调节其下游靶基因cyclin D1、cyclin B和HNF4α实现。3.低氧条件下HepG2和MHCC97-H黏附力下降、侵袭、转移力增强；Tg737及其下游靶基因polycystin-1、IL-8和TGF-β1参与了这一生物学行为。