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研究背景:甲状腺髓样癌来源于分泌降钙素的甲状腺滤泡旁细胞(c细胞),约占全部甲状腺癌的5-10%,其恶性程度介于分化性甲状腺癌与甲状腺未分化癌之间,预后相对较差,其死亡率约占所有甲状腺癌相关死亡病例的13.4%。由于c细胞不表达促甲状腺激素受体且不摄碘,传统的促甲状腺激素抑制疗法和131|核素内放射治疗无效,全身性化疗和放射治疗疗效欠佳,根治性外科手术成为绝大多数甲状腺髓样癌患者的唯一选择,治疗手段的匮乏和单一直接影响和制约甲状腺髓样癌患者的疗效和预后。关于甲状腺髓样癌发病过程中c细胞表面受体分布及内分泌激素的调控机制仍不清楚,而作为G蛋白偶联受体之一的甲状旁腺素受体,其在c细胞表面的表达、内化及调控及其信号通路与甲状腺髓样癌发病调控机制中的交互作用仍未见报道。目的:明确甲状腺C细胞表面受体分布及PTHR1在甲状腺髓样癌组织中的表达,探索PTHR1信号通路和GRK介导的AC-cAMP-PKA信号系统和Ca2+/PKC信号系统信号通路在甲状腺髓样癌发病调控机制中的交互作用,为甲状腺髓样癌的治疗提供理论支撑与新的靶点。方法:1.采用免疫组织化学法、实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTHR1, CTR、GRK2、GRK5、CaM、PKC及PKA在甲状腺髓样癌组织中的表达情况,分别从组织、蛋白和核酸水平深入研究GPCRs、 GRK表达与AC-cAMP-PKA信号系统和Ca2+/PKC信号系统信号通路的影响。2.通过甲状腺髓样癌TT细胞株的体外培养,经外源性干预添加PTH1-34和PTHR McAb,采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTHR1, CTR、GRK2、GRK5及CaM在甲状腺髓样癌TT细胞加药前后的表达情况,采用电化学发光法检测甲状腺髓样癌TT细胞株加药前后细胞培养上清液PTH和CT水平,采用放射免疫竞争结合法检测细胞内cAMP浓度和液闪记数γ-32P放射活性法检测PKC、PKC活性变化并探讨添加PTH1-34对于甲状腺髓样癌TT细胞的影响以及PTHR1表达与AC-cAMP-PKA信号系统和Ca2+/PKC信号系统信号通路。结果:1.免疫组织化学法显示PTHR1、CTR微弱-中等表达于正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌组织并强表达于甲状腺髓样癌组织,表明该受体广泛分布于正常甲状腺滤泡上皮、甲状腺乳头状癌细胞及甲状腺C细胞,并以甲状腺髓样癌组织表达最为显著。其中,各组织类型组甲状腺肿瘤PTHR中等表达无差异性(p>0.05),而各组呈强阳性表达和弱阳性表达之间有显著性差异(p<0.05);GRK2、GRK5表达于正常甲状腺、结节性甲状腺肿,二组表达之间无差异性(p>0.05);GRK2在甲状腺乳头状癌呈强阳性表达而在甲状腺髓样癌组织呈弱阳性表达(p<0.05),GRK5在甲状腺乳头状癌和甲状腺髓样癌组织呈弱阳性表达。二组表达之间差异无显著性(p>0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应结果显示在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间PTHR1mRNA、CTR mRNA表达无显著性差异(p>0.05);与正常甲状腺组比较,甲状腺髓样癌组PTHR1mRNA, CTR mRNA表达有显著性差异(p<0.05)。在正常甲状腺组与结节性甲状腺肿组之间GRK2mRNA, GRK5mRNA表达无显著性差异(p>0.05)。甲状腺乳头状癌组GRK2mRNA和GRK5mRNA表达水平明显高于正常甲状腺组,二者表达有显著性差异(p<0.05);而对于甲状腺髓样癌组,其GRK2mRNA表达水平明显高于正常甲状腺组而GRK5mRNA却明显低于正常甲状腺组,二者表达有显著性差异(p<0.05)。在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间PKA mRNA、PKC mRNA表达无显著性差异(p>0.05);甲状腺髓样癌组PKA mRNA、PKC mRNA表达水平明显高于正常甲状腺组,二者表达有显著性差异(p<0.05)。其中,在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之CaM mRNA表达无显著性差异(p>0.05);甲状腺髓样癌组CaM mRNA表达水平明显高于王常甲状腺组,二者表达有显著性差异(p<0.05)。Western blot结果显示:在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间PTHR1、CTR蛋白表达无显著性差异(p>0.05);与之比较,甲状腺髓样癌组PTHR1、CTR蛋白表达明显高于其余组,表达之间有显著性差异(p<0.05)。其中,在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间GRK2、GRK5蛋白表达无显著性差异(p>0.05);与之比较,甲状腺髓样癌组GRK2蛋白表达明显高于其余组,而GRK5蛋白表达明显低于其余组,二者表达之间有显著性差异(p<0.05)。其中,在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间PKC、PKA蛋白表达无显著性差异(p>0.05);与之比较,甲状腺髓样癌组PKC、PKA蛋白表达明显高于其余组,表达之间有显著性差异(p<0.05)。其中,在正常甲状腺、结节性甲状腺肿、甲状腺乳头状癌各组之间CaM蛋白表达无显著性差异(p>0.05);与之比较,甲状腺髓样癌组CaM蛋白表达明显高于其余组,表达之间有显著性差异(p<0.05)。2.F-12K培养基培养甲状腺髓样癌TT细胞,细胞呈长梭形、多边形或不规则形,贴壁生长,48-72小时后约80%TT细胞贴壁融合。给予PTH1-34作用后细胞数量明显减少,部分细胞出现胞体收缩变圆,细胞间隙进一步增宽,部分细胞呈现生长延缓,悬浮细胞及碎片增多;而给予PTHR McAb作用后细胞数量未见明显减少,部分细胞呈现生长延缓,细胞形态及活力未见明显改变。添加PTH1-34组TT细胞上清液上清液PTH水平明显升高p<0.05)而CT水平明显降低p<0.05),而不同剂量PTH1-34组TT细胞上清液水平之间无明显差异(p>0.05)。与甲状腺髓样癌TT细胞对照组相比较,加PTH1-34组TT细胞cAMP水平明显升高p<0.05),而PTHR McAb组TT细胞cAMP明显降低(p<0.05),不同剂量PTH1-34组TT细胞cAMP水平之间无明显差异(p>0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测表明通过降低PKC活性、升高PKA活性,从而下调GRK2表达并上调GRK5表达,从而调节GPCRs表达。PTHR1蛋白表达明显升高而CTR蛋白表达明显降低,GRK2蛋白表达明显降低而GRK5蛋白表达均明显升高,同时CaM表达明显降低,组间比较有显著性差异(p<0.05)。结论:1.甲状腺C细胞膜表面表达PTHR1和CTR,同时,由于第二信使调节激酶(PKA、PKC)在甲状腺髓样癌组织中的高表达及CaM的高表达,导致G蛋白偶联受体激酶(GRK2、GRK5)的不同表达水平即GRK2的活性增强而GRK5的活性减弱,由于GRK2和GRK5对甲状腺C细胞膜表面GPCRs即PTHR1和CTR的不同强度的磷酸化作用,最终显示甲状腺髓样癌组织中PTHR1和CTR的不同程度的上调性表达。2.通过外源性添加PTH1-34和PTHR McAb观察PTH1-34在体外对甲状腺髓样癌TT细胞株生长的影响,细胞培养上清液表明其PTH水平明显上升而CT水平下降;cAMP浓度升高同时PKA上升而PKC降低。同时CaM表达降低,GRK2表达降低而GRK5表达升高,最终激活AC-cAMP-PKA信号系统而抑制了Ca2+/PKC信号系统信号通路传导,导致甲状腺髓样癌TT细胞生长抑制,研究进一步揭示了PTHR1信号通路传导对恶性肿瘤细胞生长的影响,本研究提示PTHR1可能成为甲状腺髓样癌靶向治疗的靶点之一,为甲状腺髓样癌的治疗开辟了崭新的视角与思路。