论文部分内容阅读
目的:探讨X射线诱导心肌纤维化的发生机制,阐明当归红芪超滤物治疗放射性心肌纤维化的潜在分子机制,为当归红芪超滤物治疗放射性心肌纤维化提供实验依据,丰富了“气虚血瘀”理论的分子生物学内涵,为临床治疗放射性心肌纤维化提供新策略。方法:1建立X射线诱导的放射性心肌纤维化的细胞模型:胰酶消化大鼠乳鼠心脏组织,差速贴壁法分离大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,采用0.5Gy、1Gy和2Gy的X射线剂量行一次性照射,24小时后,Western Blot检测大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1和Col1α的表达量,ELISA试剂盒检测细胞培养液中TGF-β1的含量,评估大鼠乳鼠心肌成纤维细胞纤维化模型是否成功建立。2抑制TGF-β1,检测其对大鼠乳鼠心肌成纤维细胞OPN、Col1α和miRNA-21-5p的影响:分离培养大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分别用1μg、5μg和10μg Disitrtide抑制心肌成纤维细胞TGF-β1,Western Blot检测大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中OPN和Col1α的表达量,qPCR分析心肌成纤维细胞中miRNA-21-5p的表达量,明确TGF-β1是否参与X射线诱导的心肌成纤维细胞纤维化的发生。3干扰OPN,检测其对大鼠乳鼠心肌成纤维细胞TGF-β1、Col1α和miRNA-21-5p的影响:分离培养大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分别转染Si-NC和Si-r-Spp1,Western Blot检测各组大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1和Col1α的表达,qPCR分析心肌成纤维细胞中miRNA-21-5p的表达量,阐明OPN是否参与X射线诱导的心肌成纤维细胞纤维化的发生。4抑制miRNA-21-5p,检测其对大鼠乳鼠心肌成纤维细胞OPN、Col1α和TGF-β1的影响:分离培养大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,转染micrOFFTM mo-miRNA-21-5p,Western Blot检测大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1、OPN和Col1α的表达量,揭示miRNA-21-5p是否参与X射线诱导的心肌成纤维细胞纤维化的发生。5抑制miRNA-21-5p,检测其对大鼠乳鼠心肌成纤维细胞TNF-α、Caspase-3和ROS的影响:分离培养大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,转染micrOFFTM mo-miRNA-21-5p,Western Blot检测大鼠乳鼠心肌成纤维细胞TNF-α和Caspase-3的蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测细胞培养液中ROS的含量,确定miRNA-21-5p对X射线诱导心肌成纤维细胞凋亡和氧化应激损伤的影响。6建立放射性心肌纤维化的Wistar大鼠模型:采用6Gy、8Gy和10Gy的X射线剂量行一次性全身照射,H&E和Masson染色鉴定大鼠心脏组织心肌纤维化的程度,筛选诱导心肌纤维化最佳的X射线剂量。采用低剂量(25mg/kg/day)、中剂量(50mg/kg/day)和高剂量(100 mg/kg/day)的当归红芪超滤物通过灌胃方式干预大鼠,形态学和ELISA法测定血清TGF-β1筛选最佳抑制X射线诱导心肌纤维化的药物浓度。分离大鼠血清,通过测定大鼠血清TnT和BNP水平,鉴定心肌纤维化的大鼠模型,免疫荧光检测各组大鼠心肌组织TGF-β1和Col1α的表达,明确当归红芪超滤物保护放射性心肌纤维化的有效性。7检测当归红芪超滤物是否通过调控TGF-β1/OPN/AP-1/miRNA-21通路保护了放射性心肌纤维化:大鼠随机分为对照组、X-ray组和RAS-RH+X-ray组,双酶消化法消化大鼠心肌组织,差速贴壁法分离心肌成纤维细胞,CCK-8检测心肌成纤维细胞的增殖,qPCR检测大鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1、OPN、c-jun、c-fos、miRNA-21-3p、miRNA-21-5p和Col1α基因表达水平,Western Blot检测大鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1、OPN、P-c-jun、P-c-fos和Col1α蛋白表达水平。8检测当归红芪超滤物是否通过降低氧化应激损伤缓解了X射线诱导的放射性心肌纤维的发生:大鼠随机分为对照组、X-ray组和RAS-RH+X-ray组,ELISA法检测血清中ROS的水平及大鼠心肌成纤维细胞中SOD含量。9检测当归红芪超滤物是否通过改善大鼠心肌成纤维细胞的凋亡抵抗抑制了X射线诱导的放射性心肌纤维的发生:大鼠随机分为对照组、X-ray组和RAS-RH+X-ray组,采用H&E染色观察各组实验大鼠心肌成纤维细胞的凋亡,流式细胞仪检测大鼠心肌成纤维细胞的凋亡,分别通过qPCR和Western Blot测量大鼠心肌成纤维细胞中TNF-α和Caspase-3的基因和蛋白表达水平。结果:1通过测定TGF-β1的含量和Col1α的表达,选用1GyX射线建立了放射性心肌纤维化的心肌成纤维细胞模型:和对照组相比,0.5Gy X-ray组TGF-β1和Col1α含量增加不明显,1Gy X-ray组TGF-β1和Col1α含量明显增加,2Gy X-ray组TGF-β1含量明显增加,但Col1α表达变化不明显。结合ELISA测定细胞培养液中TGF-β1的结果,后续试验采用1GyX射线建立了放射性心肌纤维化的心肌成纤维细胞模型。2 TGF-β1通过调节OPN和miRNA-21-5p参与X射线诱导的心肌成纤维细胞纤维化的发生:qPCR和Western Blot的结果显示,和对照组相比,X-ray组心肌成纤维细胞中OPN和Col1α的表达升高,有显著统计学意义。和X-ray组相比,TGF-β1 inhibitor+X-ray组中OPN和Col1α表达明显降低,miRNA-21-5p表达模式和OPN一致。3 X射线通过OPN调节心肌成纤维细胞中TGF-β1和miRNA-21-5p的表达促进放射性心肌纤维的发生:和Si-NC组相比,Si-NC+X-ray组心肌成纤维细胞中的TGF-β1和Col1α表达明显升高(P<0.05),有统计学意义。和Si-NC+X-ray组相比,Si-Spp1+X-ray组中TGF-β1和Col1α的表达降低(P<0.05),miRNA-21-5p表达模式和TGF-β1一致。4 X射线通过miRNA-21-5p促进心肌成纤维细胞TGF-β1的表达介导了放射性心肌纤维化的发生:和Si-NC组相比,Si-NC+X-ray组心肌成纤维细胞TGF-β1、OPN和Col1α的表达升高。和Si-NC+X-ray组相比,miRNA-21-5p inhibitor+X-ray组心肌成纤维细胞TGF-β1和Col1α的表达均降低,有统计学意义,OPN的表达变化无统计学意义。5 X射线通过miRNA-21-5p促进活性氧ROS的产生、降低心肌成纤维细胞TNF-α和Caspase-3的表达:和Si-NC组相比,Si-NC+X-ray组中大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中TNF-α和Caspase-3的表达降低。和Si-NC+X-ray组相比,miRNA-21-5p inhibitor+X-ray组中TNF-α和Caspase-3表达升高,有统计学意义(P<0.05)。抑制miRNA-21的表达,和Si-NC组相比,Si-NC+X-ray组大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中ROS的含量明显升高,且具有极显著地统计学意义(P<0.01)。和Si-NC+X-ray组相比,miRNA-21-5p inhibitor+X-ray组大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中ROS的含量明显降低,有极显著地统计学意义(P<0.01)。6选用8GyX射线建立放射性心肌纤维化的大鼠模型:H&E和Masson染色显示6Gy、8Gy和10Gy的X射线剂量均能诱导Wistar大鼠心肌组织发生纤维化,8Gy和10Gy组大鼠心脏组织纤维化程度比6Gy组大鼠严重,10Gy组大鼠在X射线诱导的急性炎症反应期死亡2只,因此我们后续试验选择8GyX射线剂量。7 50mg/kg的当归红芪超滤物能有效的保护大鼠放射性心肌纤维化的发生:H&E和Masson染色揭示中高剂量的当归红芪超滤物均能缓解放射性心肌纤维化。ELISA结果显示:与对照组相比,X射线能显著性的增加TGF-β1的表达。与X-ray组相比,50mg/kg和100mg/kg的当归红芪超滤物均能显著减低X射线诱导的TGF-β1的含量,具有统计学意义(P<0.01),25mg/kg组TGF-β1的含量变化无统计学意义。与50mg/kg组相比,100mg/kg组TGF-β1的含量变化无统计学意义,因此后续试验采用当归红芪超滤物的剂量是50mg/kg。8当归红芪超滤物通过降低大鼠心肌组织TGF-β1与Col1α的表达和大鼠血清TnT的水平有效的保护放射性心肌纤维化的发生:和对照组相比,TnT在X-ray组升高,具有统计学意义(P<0.01),表明X射线诱导的心肌纤维化大鼠模型成功。和X-ray组相比,TnT在RAS-RH+X-ray组降低,具有统计学意义(P<0.05);H&E和Masson染色显示RAS-RH+X-ray组大鼠心脏组织纤维化程度降低,当归红芪超滤物有效的保护放射性心肌纤维化;免疫荧光结果显示,RAS-RH+X-ray组TGF-β1和Col1α的荧光强度降低。9当归红芪超滤物抑制了大鼠心肌成纤维细胞的增殖:CCK-8检测结果显示,和对照组相比,X-ray组大鼠心肌成纤维细胞的增殖活性明显增加。当归红芪超滤物干预后,心肌成纤维细胞的增殖活性降低,当归红芪超滤物抑制心肌成纤维细胞的增殖。10当归红芪超滤物通过调节TGF-β1/OPN/AP-1/miRNA-21通路保护了放射性心肌纤维化的发生:qPCR和Western Blot的结果显示,和对照组相比,X-ray组大鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1、OPN、P-c-fos、P-c-jun、miRNA-21-3p、miRNA-21-5p和Col1α表达水平均升高,具有统计学意义。和X-ray组相比,RAS-RH+X-ray组大鼠心肌成纤维细胞中TGF-β1、OPN、P-c-jun、miRNA-21-3p、miRNA-21-5p和Col1α表达水平均降低,具有统计学意义。P-c-fos在X-ray和RAS-RH+X-ray组中的表达无明显变化,没有统计学意义;和对照组相比,X-ray组大鼠心肌成纤维细胞中miRNA-21-5p和miRNA-21-3p的表达明显地升高,且具有显著的统计学意义(P<0.01)。RAS-RH干预后,miRNA-21-5p和miRNA-21-3p的表达明显地降低且有统计学意义,但miRNA-21-5p比miRNA-21-3p降低的更多。11当归红芪超滤物通过降低氧化应激损伤缓解了X射线诱导的放射性心肌纤维化的发生:和对照组相比,X-ray组大鼠血清中ROS含量明显升高(P<0.01),心肌成纤维细胞中SOD水平降低(P<0.05),具有显著性的统计学意义。和X-ray组相比,RAS-RH+X-ray组大鼠血清中ROS含量下降(P<0.01),心肌成纤维细胞中SOD水平增加(P<0.05),具有极显著性的统计学意义。12当归红芪超滤物通过改善大鼠心肌成纤维细胞的凋亡抵抗抑制了X射线诱导的放射性心肌纤维化的发生:(1)H&E染色的形态学结果显示,对照组心肌成纤维细胞表现为正常状态,细胞膜完整,细胞质淡红色,细胞核染色质染色均匀,核膜完整,淡蓝色或蓝色,可见散在的凋亡细胞。和对照组相比,X-ray组心肌成纤维细胞凋亡个数减少,细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色,可见凋亡小体,以分散单个形式存在。和X-ray组相比,RAS-RH+X-ray组心肌成纤维细胞凋亡个数增加;(2)流式细胞仪检测结果表明,和对照组相比,X-ray组大鼠原代心肌成纤维细胞凋亡减少(P<0.05),有统计学意义。RAS-RH干预后,和X-ray组相比,RAS-RH+X-ray组心肌成纤维细胞凋亡增加(P<0.05),有统计学意义;(3)qPCR和Western Blot的结果显示:和对照组相比,X-ray组大鼠原代心肌成纤维细胞中TNF-α和Caspase-3表达水平降低(P<0.01),有统计学意义。与X-ray组相比,RAS-RH+X-ray组心肌成纤维细胞中TNF-α和Caspase-3的表达水平升高(P<0.01),有显著的统计学意义。结论:1细胞水平的实验结论(1)TGF-β1/OPN/miRNA-21通路介导了X射线诱导的放射性心肌纤维化的发生,促纤维化分子miRNA-21、TGF-β1和OPN是X射线诱导的心肌纤维化的关键分子,TGF-β1与OPN和miRNA-21之间存在相互调节关系,OPN上调TGF-β1和miRNA-21的表达,miRNA-21促进TGF-β1的表达,TGF-β1与OPN都能上调miRNA-21的表达,促进放射性心肌纤维化的发生。(2)miRNA-21介导了大鼠乳鼠心肌成纤维细胞的凋亡和氧化应激损伤。2动物水平的实验结论(1)当归红芪超滤物通过调控TGF-β1/OPN/AP-1/miRNA-21通路保护了放射性心肌纤维化。(2)当归红芪超滤物降低了大鼠心肌成纤维细胞氧化应激损伤,缓解了X射线诱导的心肌纤维化的发生。(3)当归红芪超滤物改善了大鼠心肌成纤维细胞的凋亡抵抗,抑制了X射线诱导的心肌纤维化的发生。