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目的:上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)是指上皮细胞在特定情况下失去其极性向间质细胞表型转变的过程,其特点为细胞粘附性下降或消失,极性丧失,细胞运动能力和转移能力增强。在近十年研究中发现EMT在肿瘤和组织纤维化等病理改变中也会出现。EMT发生表现为上皮标志物E-cadherin等表达的减弱或缺失,而间质标志物Vimentin等表达增强以及一系列信号通路的异常激活。Snail为EMT主要核转录因子,能够促进肿瘤细胞EMT的发生及发展,在EMT过程当中,Snail可以直接参与诱导Vimentin的生成而抑制E-cadherin的生成。TGF-β相关信号通路为促进Snail生成的重要信号通路,TGF-β信号通路的异常活化被视为肿瘤细胞EMT发生的开端。因此,靶向TGF-β/Snail信号轴及Snail合成与核转位的药物的研发,对于抗肿瘤细胞EMT现象和肿瘤复发具有重要意义。多糖类广泛存在于动物、植物和微生物中,对机体多种生理过程具有调节作用。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是一种富含L-岩藻糖和硫酸根基团的酸性杂多糖,其中硫酸根基团是其主要功能基团。Fucoidan是海洋褐藻类植物的重要生物活性物质,Fucoidan具有免疫调节、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒和防辐射等多种药理活性。在本实验室前期工作中从裙带菜孢子叶中提取的Fucoidan具有高含量的硫酸根基团,因此具有更强的生物学活性。本实验以人肝癌细胞系Hep G2细胞为基础,采用细胞生物学,生物化学以及分子生物学等方法,探究Fucoidan能否逆转Hep G2细胞EMT表型及探究可能的分子机制。方法:1.采用MTT法,检测Fucoidan对肿瘤细胞活力的影响。2.运用划痕实验及transwell方法,检测Fucoidan对肿瘤细胞迁移的影响。3.免疫荧光法,检测Fucoidan对肿瘤细胞膜、细胞骨架的影响。4.Western-blot和Real-Time PCR法,检测Fucoidan对肿瘤细胞EMT标志蛋白Vimentin、E-cadherin表达的影响。5.采用免疫荧光、Western-blot和Real-Time PCR方法,检测Fucoidan对Snail蛋白的表达及核移位的影响。6.采用Western-blot方法,检测Fucoidan对Snail上游主要核转录因子HMGA2、HIF-1α和NF-κB的影响。7.采用Western-blot方法,检测Fucoidan对促进Snail生成主要通路TGF-β/Smads信号通路相关蛋白TGFRⅡ,Smad2/3和Smad4的影响。8.采用Western-blot方法,检测对影响Snail稳定性及核移位的信号通路PI3K/AKT/m TOR主要蛋白p-PI3K,p-AKT和p-m TOR的影响。结果:1.Fucoidan能够有效地抑制Hep G2细胞的活力。2.Fucoidan对肿瘤细胞的迁移能力有明显的抑制作用。3.Fucoidan能够改变肿瘤细胞形状及骨架结构,使肿瘤细胞形状由菱形变为类鹅卵石形状,同时细胞骨架由纺锤状变为多变形。4.Fucoidan在m RNA和蛋白水平显著影响EMT标志蛋白Vimentin和E-cadherin的表达。5.Fucoidan对Snail因子活化形式及核移位有明显的影响。6.Fucoidan对Snail上游相关核转录因子,NF-κB,HMGA2和HIF-1α均有明显抑制作用。7.Fucoidan对TGF-β/Smads信号通路相关蛋白TGFRⅡ,Smad2/3有明显抑制作用,但对Smad4的表达量有促进作用。8.Fucoidan对PI3K/AKT/m TOR信号通路中主要蛋白p-PI3K,p-AKT和p-m TOR的表达都有明显的抑制作用,而对GSK-3β表达量没有明显的影响。结论:Fucoidan对肿瘤细胞的EMT有明显的抑制作用,这种作用可能与通过影响EMT标志蛋白E-cadherin和Vimentin、抑制Snail蛋白因子的活化与核移位及Snail相关核转录因子、调节TGF-β/Smads信号通路及钝化PI3K/AKT/m TOR有关。