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微生物燃料电池(microbial fuel cell,MFC)是一种以微生物作为催化剂将有机物的化学能转化为可输出电能的装置,它是将微生物氧化代谢和电化学技术相结合的新兴能源系统。MFC以可自我再生的微生物替代了传统化学燃料电池的贵金属催化剂,并且微生物种类繁多、代谢途径丰富且易调控,理论上能够催化所有有机物甚至部分无机物氧化而产生能量,因而它是一种可以实现有机废物或污染物降解并同时产生清洁电能的技术,在污水处理、生态修复和便携式能源等领域具有巨大的应用前景。现阶段,MFC性能如低功率输出密度较低、启动速度慢和制造成本较高等限制了其商业化应用,其中MFC阳极生物电催化性能是主要的限制因素之一,然而它又在很大程度上受限于阳极产电菌与电极间的电子传递即胞外电子传递效率。具有高生物相容性的纳米结构阳极通常能够显著地增强MFC阳极生物电催化效率,但是纳米结构阳极的表面性质和孔结构等因素对产电菌胞外电子传递效率的影响以及产电菌自身在纳米结构界面的电化学行为尚不完全清楚,而这对于合理定向设计高性能的纳米结构阳极材料是具有指导性意义的。本研究以腐败希瓦氏菌CN32(Shewanella putrefaciens CN32)为产电菌株,通过制备三种不同纳米结构和表面性质的阳极材料,研究它们对S.putrefaciens CN32阳极产电能力和胞外电子传递效率的增强作用,并通过分子生物学方法研究S.putrefaciens CN32细胞输出胞外电子的途径,从胞外电子传递所涉及的产电菌株和电极材料两方面系统地研究MFC阳极胞外电子传递机制。主要研究内容和结果如下:1.以传统碳布作为双室MFC阳极时,本研究所采用S.putrefaciens CN32菌株的产电能力明显高于常用模式菌株S.oneidensis MR-1,并且S.putrefaciens CN32菌株利用黄素类电子介体提高阳极生物电催化的能力也显著高于S.oneidensis MR-1。为了促进S.putrefaciens CN32自分泌黄素类电子介体从而提高阳极生物电催化性能,采用溶胶-凝胶法和水热还原法合成了二氧化钛/还原氧化石墨烯(TiO2/rGO)纳米复合阳极材料。在该复合材料中,微小的TiO2纳米晶体均匀地生长在rgo片层上,有效地抑制了氧化石墨烯(go)片层在水热还原过程中发生严重聚集,增加了纳米复合物的比表面积和介孔体积,并且明显提高了纳米复合物的亲水性。tio2/rgo纳米复合物中tio2纳米晶体和rgo对阳极生物电催化具有独特的协同增强作用:均匀生长的tio2纳米晶体提高了rgo的比表面积和亲水性从而促进了大量的s.putrefacienscn32细胞在纳米复合物表面粘附生长,s.putrefacienscn32细胞在tio2纳米晶体的刺激下分泌更多的黄素类物质从而提高电子介体的浓度,而rgo的高导电性又可以确保电子介体在s.putrefacienscn32细胞与纳米复合阳极间快速的直接电化学过程。这种独特的协同作用显著地加速了电子介体的直接电化学,降低了阳极界面电荷转移电阻,从而使得tio2/rgo纳米复合阳极在以lb培养基为阳极液底物时的mfc最大输出功率密度为540mwm-2,分别是单独rgo和传统碳布阳极的1.4倍和3.4倍。2.为了分析生物膜对s.putrefacienscn32mfc阳极生物电催化的作用,采用一步水热法和冷冻干燥技术制备了最常用的两种mfc阳极纳米碳材料——碳纳米管(cnt)和石墨烯的多孔复合物,通过调控多壁碳纳米管(mwcnt)和go的比例获得了具有最佳多层次孔结构的mwcnt@rgo1:2纳米复合物,该复合物中适量的1dmwcnt不但有效抑制了go在热还原过程中发生片层间堆积而且作为纽带增加了2drgo片层间的多方向连接,所形成的碳质网络结构既提高了电化学活性面积又增加了电子传递通道和效率。因此,相比于单独的mwcnt和rgo,mwcnt@rgo1:2纳米复合阳极同时增加了电容性电流和法拉第峰电流,并且显著地降低了界面电荷转移电阻。mwcnt@rgo1:2纳米复合物优越的3d多层次孔结构和碳材料固有的高生物相容性使得s.putrefacienscn32细胞在其表面和内部大量生长形成致密的生物膜,mwcnt@rgo1:2生物膜阳极在双室mfc中的最大输出功率密度为789mwm-2,显著高于单独的mwcnt和rgo阳极,是传统碳布阳极的6倍。mwcnt@rgo1:2阳极电流的产生主要来源于阳极生物膜中的细菌而不是阳极液中游离细菌,因此说阳极生物膜对高效的s.putrefacienscn32mfc电流的产生是至关重要的。阳极生物膜中高密度的s.putrefacienscn32可以分泌更多的电子介体,在阳极界面局部区域富集高浓度的电子介体导致高效的电子介体直接电化学,从而显著地增强了阳极生物电催化性能。3.制备细菌可利用的大孔结构的mfc阳极材料来增加产电细菌的载量是近年来的主流趋势,众所周知mfc阳极反应同时涉及生物催化和电催化两方面,但是在这些大孔结构阳极获得高效生物催化时,纳米孔结构对电催化尤其是电子介体直接电化学的影响一直被人们所忽视。为了探究这个问题,通过在惰性气氛中高温碳化生物质材料——细菌纤维素膜制备了3d碳纳米纤维(cnf)气凝胶,它是由碳纳米纤维组成的,具有微米级大孔的网络结构和天然的高生物相容性,因而在其表面和孔结构内部均生长有大量的S.putrefaciens CN32细胞,从而获得了非常高的生物催化剂的载量。通过改变碳化温度巧妙地调控了CNF气凝胶的纳米孔结构(<10 nm),随着碳化温度的升高,CNF气凝胶中微孔逐渐转化为介孔后,黄素类电子介体的直接电化学显著地增强,表明介孔结构是高效的电子介体直接电化学所必需的。首次提出了介孔结构增强电子介体直接电化学的独特机制:介孔结构不仅增加了电子介体可利用的表面积,而且介孔内凹凸不平的表面以及适当的扭曲结构克服了RF和FMN分子的空间位阻从而实现两个电活性氮原子的同时吸附和反应,即实现两电子转移。富含介孔的CNF1000阳极在S.putrefaciens CN32MFC中的最大功率输出密度为1747 mW m-2,分别是CNT和碳布阳极的4倍和14倍,在外接电阻为1000?时的最大平台电流输出密度为3.9 A m-2,具有很好的稳定性和重复使用性,在可持续操作方式的工业领域具有良好的应用前景。4.为了研究S.putrefaciens CN32的外膜色素蛋白MtrC和UndA对其胞外电子传递的作用,采用框内缺失法对mtrC和undA基因进行单基因和双基因的无痕敲除,获得了相应的缺失突变株。野生株和缺失株在有氧条件下以乳酸作为单一碳源和电子供体时的代谢生长能力及其合成分泌黄素类物质的能力没有差异,表明缺失色素蛋白MtrC和UndA对S.putrefaciens CN32的有氧代谢的影响不显著。在MFC运行条件下,对比接种S.putrefaciens CN32野生株和不同缺失株的阳极产电能力发现缺失mtrC或undA基因均会降低S.putrefaciens CN32的产电能力和MFC启动速度,缺失mtrC基因的降低作用显著地大于缺失undA基因,表明色素蛋白MtrC在S.putrefaciens CN32胞外电子传递中起着更为重要的作用。通过实时监测阳极液中黄素类电子介体的浓度和比较添加外源核黄素促进阳极产电能力的效果,发现外膜色素蛋白MtrC是S.putrefaciens CN32胞外还原黄素类电子介体的关键终端酶,它是对S.putrefaciens CN32阳极高效生物电催化的主要作用是通过快速的电子介体直接电化学而不是直接将电子传递给电极,通过对比野生株和?mtrC缺失株对甲基橙脱色效果的差异进一步证实了这一结论。综上所述,S.putrefaciens CN32在纳米结构阳极界面的胞外电子传递最主要的方式是自分泌的黄素类电子介体介导的间接电子传递途径,最有效的纳米结构阳极材料应该既能促进阳极生物膜的生长又能加速电子介体直接电化学,从而同时实现高效的生物催化和电催化反应。