论文部分内容阅读
[目的]为研发出结构新型、活性强且具有我国自主知识产权的CCR5拮抗剂,本研究对中科院上海药物研究所送筛的27个化合物进行体外抗HIV-1活性初步研究,并发现2个活性最佳、治疗指数最高的化合物DC521042和DC521043,然后采用多株HIV-1病毒株和4种细胞对其抗HIV活性药效学进行评价,并选取DC521042与不同类型已上市药物进行联合抗HIV活性研究。[方法]首先采用MTT法检测DC521042和DC521043对不同细胞系的细胞毒性作用;用荧光素酶活性实验检测了 DC521042和DC521043对不同HIV-1实验株在TZM-b1细胞中复制的抑制作用;以ELISA方法捕捉HIV-1 p24抗原检测DC521042和DC521043对3种HIV-1临床分离株在PBMC中复制的抑制作用以及对实验株HIV-1Ba-L感染2种细胞的抑制作用。用荧光素酶活性实验和ELISA方法检测了 DC521042 分别与 AZT、FTC、TDF、3TC、ETR、NVP、EFV、DTG、RAL、IDV、T-20和MVC等12种上市临床抗HIV药物的联合用药对HIV实验株感染在细胞内复制的抑制作用。实验均以马拉维诺(MVC)作为阳性对照药物。[结果](1)DC521042 和 DC521043 对 TZM-b1、PM1、HOS-CD4-CCR5 细胞的毒性较小,CC50均大于200 μM。但是对人原代PBMC存在一定的细胞毒性,CC50分别为 102.51±1.19 μM 和 81.70±3.63 μM。(2)DC521042和DC521043能有效地抑制3种HIV-1实验株在TZM-b1细胞中的复制:DC521042 抑制 HIV-1Ba-L、HIV-1YU-2和 HIV-1SF-162在 TZM-b1 细胞中复制的 EC50分别为 9.96±4.33 nM 和 16.93±2.90 nM、2.89±0.55 nM。DC521043抑制 HIV-1Ba-L、HIV-1YU-2和 HIV-1SF-162在 TZM-b1 细胞中复制的 EC50 分别为8.73±0.34 nM、7.64±0.55 nM 和 15.99±3.87 nM。(3)DC521042和DC521043亦能强效抑制实验株HIV-1Ba-L在PM1和HOS-CD4-CCR5 细胞中的复制:DC521042 和 DC521043 抑制 HIV-1 Ba-L在PM1 和 HOS-CD4-CCR5 细胞中复制的 EC50 分别为 0.29±0.12 nM 和 0.50±0.36 nM、0.70±0.27 nM 和 2.37±1.80 nM。(4)化合物DC521042和DC521043能够有效地抑制整合酶抑制剂耐药株HIV-1YU-2(G140S/Q148H)茌TZM-b1细胞中的复制,其EC50平均值分别为2.71 ±0.34nM 和 4.34±1.61 nM。(5)化合物DC521042 和 DC521043 对临床株HIV-1KM018、HIV-1KIZ001和 HIV-1kIZ006均有很好的抑制作用:化合物DC521042对HIV-1KM018、HIV-1kIZ001、HIV-1KIZ006 的 EC50 分别为 23.31±13.61 nM 和 32.04±11.24nM、5.26±1.74 nM。化合物 DC521043 对 HIV-1KM018、HIV-1 KIZ001、HIV-1KIZ006 的 EC50 分别为7.82±0.61nM、19.01±10.84 nM 和 12.61±0.62nM。(6)化合物DC521042和DC521043对X4嗜性病毒株HIV-1ⅢB或R5/X4双嗜性病毒株HIV-1A17无抑制活性,EC50分别大于1000 nM和500 nM,与阳性对照药物MVC结果一致。(7)DC521042与核苷类逆转录酶抑制剂AZT、3TC、TDF、FTC、NVP联合用药抑制HIV-1YU-2感染TZM-b1细胞的联合指数分别为0.60±0.02、0.69±0.01、0.47±0.25、0.44±0.16、0.41±0.03,均表现出协同作用,DC521042 与非核苷类逆转录酶抑制剂EFV、ETR联合用药的联合指数分别为0.85±0.08和0.75±0.38,存在中度协同作用。DC521042与蛋白酶抑制剂IDV联合用药表现出相加作用,其联合指数为0.95±0.04。DC521042与整合酶抑制剂RAL、DTG联合使用的联合指数分别为0.46±0.03与0.50±0.14,均表现出协同作用。DC521042与融合抑制剂T-20联合用药表现出协同作用,其联合指数为0.33±0.05。DC521042与MVC联合使用的联合指数为1.33±0.08,表现出拮抗作用。[结论]DC521042和DC521043对不同的宿主细胞显示出不同的细胞毒性,对TZM-b1、PM1、HOS-CD4-CCR5细胞的毒性较小,对人原代PBMC存在一定的细胞毒性,而阳性对照药物MVC对4种细胞的毒性均较小。DC521042和DC521043对不同的R5嗜性实验株均有很好的抑制效果,活性优于阳性对照药物MVC;DC521042和DC521043对同一病毒在不同细胞内的抗HIV活性与阳性对照药物MVC相当。DC521042和DC521043对不同临床分离株也有很好的抑制效果,抗HIV-1KM018活性不及阳性对照药物MVC,但是抗HIV-1KIZ001、HIV-1K1Z006的活性优于MVC;对整合酶抑制剂耐药株同样具有很好的抑制效果,活性与阳性对照药物相当;DC521042和DC521043对X4和R5/X4嗜性耐药株无抑制效果,与阳性对照药物MVC结果相似,表明DC521042和DC521043是CCR5特异性抑制剂。DC521042能与核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂、融合抑制剂联合用药呈现出协同作用,与CCR5拮抗剂呈拮抗作用,提示DC521042与MVC作用于同一靶点而形成竞争性抑制作用。以上结果表明,DC521042和DC521043对R5嗜性HIV-1病毒株有很好的抑制活性,其中DC521042的抗R5嗜性HIV-1活性优于MVC或与之相当,DC521042可以作为一种新型的CCR5拮抗剂类候选化合物继续开发,同时也为设计新的CCR5拮抗剂提供了参考。