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目的:气道黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病包括慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘和肺囊性纤维化等疾病的一个重要病理特征。人支气管上皮细胞黏液增多是炎症级联反应的结果,水、无机盐离子和黏蛋白(mucin, MUC)等大分子构成气道黏液层,黏液潴留可导致病变气道阻塞加重,并为气道定植细菌提供良好的培养基,同时可释放多种促分泌因子加剧黏液潴留过程[1,2,3],从而加快疾病的进程并使病情恶化。理论上黏液层物理和化学性质的任何改变都会影响黏液性状和分泌量,已知MUC5AC是气道主要分泌型MUC,是超负荷生成病理性黏液中的主要成分,作为炎症气道黏蛋白的主要特征性表型,决定着高分泌黏液的病理特征[4,5]。目前对MUC5AC基因表达和分泌的相关分子机制已广泛开展,已知体内多种炎症介质和细胞外因素如白介素(interleukin, IL)-4、IL-13、IL-9、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)、中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase, NE) [11]、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)配体[12]、空气污染物[13]、细菌产物[14]、类花生酸类、自由基[15]和氧化应激[16]等刺激均可以导致MUC5AC的异常,但是对临床上常见的高渗盐水可诱导排痰的分子机制却并不清楚,渗透压改变的条件下对MUC5AC分泌的效应尚无报道。既往研究发现气道上皮细胞黏液出胞过程中黏液分泌颗粒复合物形成必需热休克蛋白(heat shock proteins, HSP)70参与[17], HSP70可在多种刺激下诱导表达以保护气道细胞,并与蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)有关[18],渗透压反应增强子结合蛋白(osmotic response element binding protein, OREBP/ nuclear factor of activated T cells, NFAT5/ toncity-responsive binding-protein, TonEBP)是哺乳动物细胞内唯一已知渗透压相关转录因子,可调控HSP70等的表达,保护细胞免受高渗应激[19]。本研究选用体外培养人支气道上皮细胞株HBE16的方法,以常见的高渗盐水作为干预因素,探讨渗透压刺激对MUC5AC分泌的效应,以及HSP70、PKC和OREBP在黏液分泌中的机制,研究高渗下OREBP对HSP70的调控作用及其对MUC5AC分泌的影响,从而深入阐明高渗在气道慢性炎症性疾病黏液分泌中的可能机制,并为能从基因和分子水平解释有效的临床防治措施提供实验依据。方法:细胞培养和高渗处理:体外培养正常人气道上皮HBE16细胞株,加入10%高渗氯化钠配成不同浓度的高渗培养基,渗透压计检测渗透压。高渗培养前用无激素和无血清培养基培养。四甲基偶氮唑盐光吸收法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT法)检测细胞活性。PKC各亚型抑制剂和OREBP siRNA做为干扰因素处理高渗培养HBE16细胞。蛋白表达和转录水平的检测:采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测培养上清中MUC5AC蛋白含量作为评价黏液分泌量的指标;Western Blot检测HSP70-2和OREBP蛋白表达,RT-PCR方法半定量检测HSP70-2转录水平。细胞免疫化学和激光共聚焦技术观察细胞在高渗下HSP70-2和OREBP蛋白表达的变化。HSP70-2基因上游不同长度启动子序列荧光素酶(luciferase, Luc)报告基因质粒载体的设计和构建:从HBE16细胞中抽提人基因组DNA序列为模板,根据HSP70-2基因启动子上游调控区的基因序列及质粒表达载体pGL3-Basic的结构特点及实验需要设计扩增引物,PCR扩增HSP70-2基因启动子上游5’端不同片断,经酶切和DNA测序鉴定证实HSP70-2基因启动子上游序列系列截短的荧光素酶报告基因表达质粒构建成功。含人HSP70-2基因启动子渗透压反应增强子(osmotic response element, ORE)位点定点突变序列荧光素酶报告基因质粒载体的设计和构建:基因启动子软件分析提示HSP70-2基因启动子上游存在两个潜在的ORE,ORE1位于转录起始点-1975位,ORE2位于-93位。ORE的共有序列为:TGGAANNNYNY (Y为T或C,N为任一碱基)。设计并导入定点突变引物使HSP70-2启动子上游的两个ORE位点分别单独失活。含人HSP70-2基因上游ORE位点定点突变序列荧光素酶报告基因质粒经酶切和DNA测序鉴定证实构建成功。细胞转染和荧光素酶活性测定:报告基因质粒和OREBP siRNA通过脂质体2000共转染HBE16细胞,连续培养24h和48h后加高渗处理,12小时孵育后收集细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统计算报告基因的相对表达水平。结果:1、高渗能有效刺激HBE16细胞培养上清MUC5AC蛋白分泌量增加,与对照组相比较差异显著,有统计学意义,且结果显示在所选实验浓度范围内(500和600mOsm/kgH2O) MUC5AC随培养时间和培养浓度的改变对高渗盐水刺激有时间和剂量依赖关系(p < 0.05)。当渗透浓度增加到1000mOsm/kgH2O时HBE16细胞存活率降低,与对照组相比,差异有显著性(p < 0.05)。2、高渗培养后,OREBP和HSP70-2蛋白在细胞内的荧光表达显著增加,HSP70-2蛋白和转录水平较对照组显著升高,并随着培养时间的延长而逐渐增加(p < 0.05),同时OREBP蛋白表达增加,且随培养时间延长而逐渐增加(p < 0.01)。3、用PKCμ抑制剂G?6976处理高渗培养下HBE16细胞,培养上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和转录水平较高渗组显著降低(p < 0.01),但仍高于对照组(p < 0.05);而PKCα抑制剂Safingol,PKCβ抑制剂LY333531和PKCδ抑制剂Rottlerin处理细胞后,上述指标水平无显著改变。4、siRNA抑制OREBP表达后,高渗刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相对含量显著减少(p均<0.05)。5、成功构建系列截短的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒,真核细胞转染技术与OREBP siRNA共转染导入HBE16细胞,观察高渗刺激下的细胞,结果显示转染分别含2、1、1个ORE位点的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc细胞后在高渗刺激下的荧光素酶比活性无明显改变(p>0.05);而转染HSP70-2启动子不含ORE位点的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc细胞在高渗刺激下的荧光素酶比活性与高渗组的细胞相比显著降低(p<0.01)。6、构建突变-1975位点的ORE1和位于-93位点的ORE2的HSP70-2启动子报告基因载体,与OREBP siRNA共转染细胞后检测,突变ORE1后细胞在高渗刺激下的荧光素酶表达与高渗组相比无显著改变(p>0.05);突变ORE2后高渗刺激下的荧光素酶比活性与高渗组比较显著降低有统计学意义(p<0.01)。结论:1、高渗刺激可诱导体外培养的HBE16细胞MUC5AC分泌,在所选实验浓度范围内呈现时间和浓度依赖关系,但同时高渗对HBE16细胞活力的影响也逐步加大,随渗透时间延长和渗透浓度加大细胞存活率下降。2、高渗培养后,OREBP和HSP70-2蛋白在细胞内的荧光表达显著增加,HSP70-2蛋白和转录水平,OREBP蛋白水平均显著增加,提示HSP70-2和OREBP参与高渗致HBE16细胞MUC5AC分泌过程。用PKCμ抑制剂处理高渗培养下细胞,HSP70-2蛋白、转录水平和MUC5AC分泌较高渗组显著减少,但仍高于对照组;而用PKCα抑制剂、PKCβ抑制剂和PKCδ抑制剂处理后HSP70-2蛋白、转录水平和MUC5AC分泌均无改变,考虑高渗致黏液分泌可能是部分通过PKCμ-HSP70-2依赖的信号通路。siRNA抑制OREBP表达后,高渗刺激下的OREBP、HSP70-2和上清MUC5AC蛋白相对含量显著减少,进一步证实OREBP和HSP70-2参与高渗下黏液分泌的过程。3、成功构建系列截短的HSP70-2上游启动子荧光素酶报告基因质粒和含两个ORE位点突变的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒,为今后深入开展高渗对黏液分泌的调控机制奠定基础。4、高渗刺激可分别诱导HSP70-2启动子含2、1、1个ORE位点的pGL3-HSP70-2(-2181/+165)-Luc、pGL3-HSP70-2(-1394/+165)-Luc和pGL3-HSP70-2(-353/+165)-Luc序列的报告基因质粒仍然表达荧光素酶,而不含ORE位点的pGL3-HSP70-2(-66/+165)-Luc序列的报告基因质粒对高渗刺激无反应,不表达荧光素酶,说明在HSP70-2启动子上游-66到-353序列之间存在ORE关键位点。5、高渗刺激可诱导HSP70-2启动子-1975位点的ORE1发生定点突变序列的报告基因质粒表达荧光素酶,而含有-93位点的ORE2发生定点突变序列的报告基因质粒对高渗刺激无明显反映,提示高渗盐水诱导OREBP通过与HSP70-2启动子上-93位点的ORE结合而激活HSP70-2转录并促进HBE16细胞MUC5AC高分泌。