水稻（Oryza sativa）是世界上很重要的经济和粮食作物之一,因为全球温室效应的出现并不断扩大范围,高温对植物所造成的损害是我国水稻种植区急于解决的问题。已经有的研究发现,miRNAs在植物趋利避害及生长发育调节等扮演着不可替代的角色,但是水稻在高温胁迫下miRNAs的调控机制比较复杂,相关的研究还不够透彻清晰。本研究中通过高通量测序技术的方法对水稻热敏品种9311和耐热品种N22进行了miRNAs测序和分析,鉴定水稻孕穗期高温胁迫应答的关键miRNAs;同时,还利用分子生物学技术手段探究水稻miR398及其靶基因Os CSD2的作用机理。主要取得的结果如下:1.通过构建水稻9311和N22高温逆境胁迫下8个s RNA文库,高通量测序及序列分析表明,9311和N22幼穗中s RNA纯净序列（clean reads）分别为17,157,478个（80.44%）和17,874,788个（83.51%）,这保证了本次测序的质量和数据可靠性。测序数据分析挖掘了933个miRNAs,其中已知miRNAs为464个,未知miRNAs为469个（包括125个新miRNAs）,这些miRNAs共靶向14780个候选靶基因。对所有的miRNAs进行了差异表达筛选,结果发现有165个miRNAs的表达具有明显的差异,其中有95个是上调表达,70个是下调表达。为了弄清楚这些差异表达明显的miRNAs的靶基因功能,开展了GO分析,结果发现这些靶基因参与了ATP结合、细胞组分、转录调控、DNA结合、代谢过程、金属离子结合、细胞过程等。同时,还通过KEGG通路分析来揭示这些靶基因所参与的信号通路,发现苯丙氨酸代谢通路最为显著,且在这个通路中有4个miRNAs调控10个靶基因。此外,本研究还对表达明显的10个关键miRNAs及其靶基因进行了验证,发现水稻miR156f-5p、miR166k-5p、miR397b、miR398b、miR399d、miR408-3p、miR528-5p、miR5496和novel＿miR＿15的相对表达量与其靶基因的表达不一致,呈现负相关,而miR164c正向调控其靶基因。这表明miRNA与靶基因在不同时间高温处理下,其相对表达量出现不同的变化趋势,这为我们以后研究水稻miRNA398及其靶基因的功能提供了很重要的依据。2.通过短串联靶标模拟（STTM）技术获得水稻STTM398突变体株系;成功构建了OE-MIR398a前体过表达载体,利用水稻的遗传转化,相关的检测及水稻培育等过程,得到了T2代水稻的过表达转基因植株。水稻结实成熟期T2代株系形态学观察,发现OE-MIR398a过表达转基因水稻的株高、穗长和结实率的平均值均明显高于野生型;而突变体STTM398株系的株高、穗长和结实率平均值却显著低于野生型;过表达OE-MIR398a转基因植株的千粒重、粒长、粒宽和粒长/粒宽的平均值与野生型相比没有明显变化;STTM398突变体株系的千粒重、粒长和粒宽的平均值均显著低于野生型。这些数据就说明了水稻miR398a可能参了水稻生长发育的调控。3.水稻苗期、孕穗期进行了高温胁迫实验,结果发现了过表达OE-MIR398a和野生型水稻植株的存活率明显高于突变体STTM398,孕期期过表达OE-MIR398a和野生型株系在胁迫后的抽穗、开花时间都要早于STTM398突变体植株;DAB染色,SOD等生理检测还发现了突变体STTM398水稻植株的叶片损伤的程度要明显强于野生型和过表达OE-MIR398a水稻株系;花粉活力检测的时候还发现,野生型、过表达OE-MIR398a水稻植株的碘染色率要明显高于突变体STTM398植株。利用q RT-PCR检测基因表达,发现正常情况下OE-MIR398a株系中miR398a的表达在苗期和孕穗期都要显著高于野生型水稻株系,而其在STTM398突变体株系中的表达量却明显的低于野生型。上述实验结果说明了过表达水稻miR398a在一定程度上提高了水稻的耐高温性,而沉默干扰miR398却降低了水稻的耐热性能,这些实验及检测就说明了水稻miR398可能参与应答高温逆境胁迫。4.为了明确水稻miR398a与靶基因Os CSD2的作用关系,我们开展了RLM-5’RACE验证实验,结果发现miR398a与靶基因Os CSD2的作用位点有两个。然后通过CRISPR/Cas9技术分别在两个不同切割位点处设计靶序列,分别构建了单靶点CSD2-T1、CSD2-T2和双靶点CSD2-T1T2敲除载体,并通过遗传转化得到了水稻T2代突变体阳性植株。最后我们进行了突变体水稻苗期高温胁迫及基因表达实验,发现Os CSD2突变体株系的存活率明显要低于野生型,而且正常情况下突变体株系中Os CSD2基因的相对表达量也要低于野生型,这就推测水稻Os CSD2基因受高温诱导,参与了水稻耐热性调控。