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目的1观察钙调蛋白抑制剂N-(6-氨基己烷基)-5-氯-1萘-黄胺(W-7)对N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartate,NMDA)诱导的体外培养的乳鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及机制。2观察钙调蛋白抑制剂W-7对戊四唑(Pentylenetetrazol,PTZ)诱导的癫痫大鼠模型的保护作用及机制。方法第一部分取原代培养7天的乳鼠大脑皮质神经元随机分为5组:(1)正常对照组:仅用杜氏改良低糖型F12培养基(Dilbecco’s modified eagle medium/F12,DMEM/F12)完全培养基。(2)NMDA损伤组:去除正常神经元培养液,加入NMDA 50μmol/L,处理时间10min。(3)3个剂量的W-7保护组:分别为保护组-1:25μmol/L,保护组-2:50μmol/L,保护组-3:100μmol/L,先加入W-7,培养24h后加入NMDA 50μmol/L。MTT法检测细胞存活力;在荧光显微镜下观察皮质神经元的形态;丫啶橙染色检测凋亡细胞数量;检测培养上清液中乳酸脱氢酶(Lactic acid dehydrogenase,LDH)含量;用免疫细胞化学染色法及免疫印记法检测皮质神经元内核转录因子κB(Nuclear factorkappa B,NF-κB)p65、p38半胱氨酸基天冬氨酸(Cysteiyl aspartate specificproteinase,MAPK)蛋白的表达。第二部分健康SD大鼠38只,随机分为5组,对照组(腹腔注射生理盐水)、PTZ组(腹腔注射PTZ)和三个剂量的W-7组(腹腔注射PTZ和W-7)。观察行为学表现;脑组织中LDH含量测定;HE染色观察神经元的形态学改变;免疫组织化学方法和免疫印记方法检测海马组织NF-κBp65、p38MAPK和半胱氨酸基天冬氨酸(Cysteiyl aspartate specific proteinase,caspase)-3蛋白表达的变化。结果第一部分(1)同对照组比较,NMDA损伤组神经元凋亡增加(P<0.01),W-7组减少,呈剂量依赖性(P<0.05)。(2)NMDA组培养上清液中LDH含量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);W-7干预组LDH含量低于NMDA组,差异均有显著性意义(P<0.05);(3)NMDA组NF-κB、p38MAPK蛋白表达增加(P<0.01),W-7干预组表达减少,呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。第二部分PTZ诱导的癫痫大鼠发作程度为Ⅳ-Ⅴ级,W-7保护组发作程度明显减轻,表现为Ⅰ-Ⅲ级发作(P<0.05)。PTZ组脑组织LDH含量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),W-7保护组同PTZ组比较,LDH含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),免疫组织化学染色和免疫印记实验显示,PTZ组caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达明显增强(P<0.01),三个剂量的W-7组表达明显减弱,其差异均具有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。结论1 NMDA导致体外培养的乳鼠大脑皮质神经元NF-κBp65、p38MAPK蛋白表达增高,促进神经元凋亡。2不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7可减轻NMDA诱导的皮质神经元的损伤,具有保护作用,其作用机制是通过抑制NF-κBp65、p38MAPK的蛋白表达实现的。3 PTZ导致癫痫大鼠模型脑组织中caspase-3、NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达增高,提示PTZ癫痫模型可导致以凋亡为主的神经元损伤。4不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7对PTZ诱导的癫痫大鼠具有保护作用,其作用机制是通过抑制caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK的蛋白表达实现的,可干预癫痫的发生和发展过程。