威兰胶是鞘氨醇单胞菌在代谢过程中产生的一种微生物多糖,因其理化性质独特,近年来被广泛应用于石油、食品、医药和建筑等行业。本文以预测的威兰胶合成途径为依据,选取催化级联反应的酶UgpG（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）和WelB（葡萄糖磷酸异戊二烯转移酶）为研究对象,借助TALE-DNA人工支架,使二者形成多酶复合体,模拟底物沟道传递效应,尝试构建高产威兰胶菌株,为后续通过代谢工程方法理性改造菌株,调控威兰胶代谢奠定理论基础。本论文研究内容如下:首先,构建了Bio Brick载体质粒以及含DNA支架、TALE片段的工具质粒。首先,改造pBBR1MCS-3质粒,消除pBBR1MCS-3质粒上的自带的Spe Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点,利用PCR分别扩增改造后质粒的基因表达区和质粒骨架部分,在启动子的上游和终止子的下游分别引入Afl Ⅱ、Spe Ⅰ和Xba Ⅰ、Bgl Ⅱ四个酶切位点,通过In-fusion cloning的方法得到Bio Brick载体质粒。随后,设计了含有TALE结合基序的BM1和BM2的DNA支架,将组成DNA支架的两个片段分别从质粒pUC57-S1-1、pUC57-S1-2上切下,利用同尾酶连接的方法将二者连接后克隆至pNW33N,得到含DNA支架的质粒pDNA-scaffold。最后,根据DNA支架上的BM序列确定可特异性识别二者的TALE序列,利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0试剂盒组装TALE1和TALE2的编码基因,得到含TALE片段的质粒pTALE1、pTALE2。其次,借助TALE-DNA支架构建多酶复合体。首先,将组装好的TALE1和TALE2片段克隆到Bio Brick质粒pBBR1SMCS-BB上,成功构建质粒pBBR1SMCS-BB-T1、pBBR1SMCS-BB-T2。随后,通过PCR扩增Sphingomonas sp.WG的ugpG和welB基因片段,分别克隆到pBBR1SMCS-BB-T1、pBBR1SMCS-BB-T2质粒上,构建质粒pBBR1SMCS-BB-T1-ugpG和pBBR1SMCS-BB-T2-welB,使相应的基因片段与TALE片段可以融合表达。利用Bio Brick载体特征,将TALE1-ugpG、TALE2-welB片段与pBBR1SMCS-BB质粒进行三片段连接,成功构建含TALE1-ugpG、TALE2-welB的质粒pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B。最后,将构建好的DNA支架克隆到pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B质粒上,得到含有TALE-DNA支架的多酶复合体质粒pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS。最后,以菌株Sphingomonas sp.WG为受体菌,Escherichia coli pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B以及Escherichia coli pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS为供体菌,Escherichia coli pRK2013为辅助菌进行三亲杂交,并通过改变三亲杂交实验中受体菌的培养基种类、各菌株（供体菌、辅助菌、受体菌）的接合比例以及接合时间、受体菌的状态和培养时间等条件,对三亲杂交的条件进行了探索。但由于转入质粒过大、菌株代谢负担重等原因,获得的重组菌生长较慢、菌落较小,后续需要对实验方案进行进一步优化,以获得真正高产的威兰胶菌株。