恶性黑素瘤（MM）是致死率最高的皮肤肿瘤，此肿瘤特点是恶性程度高、易于转移、预后较差、死亡率较高，五年生存率低于11%。目前的治疗方法仍不令人满意，尤其是转移性黑素瘤。至今尚不完全清楚恶性黑素瘤发生侵袭、转移的机理，如果能揭示某些与恶性黑素瘤侵袭和转移紧密相关的重要因素，尤其是阐明参与黑素瘤细胞移动、浸润能力调控的信号转导通路将对侵袭性黑素瘤的分子识别及靶向治疗非常重要。文献报道在人体肿瘤细胞的移动、增殖及浸润中Ca²⁺发挥积极调控作用，在肿瘤细胞的浸润和转移中Ca²⁺介导的信号也是一个重要的节点，有关Wnt/Ca²⁺信号通路与肿瘤发生、发展的关系已成为研究者关注的热点，但其确切的调控机理仍不是特别清楚。活化T细胞核因子（NuclearfactorofactivatedT-cells，NFAT）最早发现于T细胞内，是一种Ca²⁺依赖的的转录因子，大量研究认为它和人体多种恶性肿瘤的发生和发展相关。根据目前的研究结果，结合我们实验组的前期研究，我们认为，在一些肿瘤细胞中存在一条Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路，这条信号通路可能在黑素瘤中被激活，并参与了黑素瘤的侵袭、转移过程。如果能通过实验证实这条信号通路的存在，并明确其作用及调控机理，将为阐明恶性黑素瘤的发病机理起到重要作用，并为黑素瘤患者的靶向治疗提供重要的理论依据。为此，我们首先分离、培养正常皮肤黑素细胞及来源于不同生长期的三株黑素瘤细胞系，采用RT-PCR法和Western-blot法检测Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路中主要的信号分子Wnt5a、DVL（散乱蛋白）、Calcineurin（钙调神经磷酸酶）、NFAT2、COX-2（环氧合酶2）、VEGF（血管内皮生长因子）、Vinculin（纽带蛋白）、Vimentin（波形蛋白）的表达水平，再用激光共聚焦扫描显微镜检测这四株细胞内的Ca²⁺浓度，最后用免疫组化检测色素痣（良性黑素细胞肿瘤）及原位、侵袭性和转移性黑素瘤的临床组织标本中NFAT2和Calcineurin-B的表达。目的是证实Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信号通路在不同发展期黑素瘤细胞中的激活状态。实验一Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT通路信号分子在正常黑素细胞和不同生长期黑素瘤细胞中的表达采用RT-PCR和Western-blot方法，检测了皮肤正常黑素细胞和分别来源于原位、侵袭性和淋巴结转移的WM793B、LIBR和SK-MEL-5恶性黑素瘤细胞系中Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin及Vimentin八个信号分子的表达。结果显示：Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2及COX-2等八个分子在皮肤正常黑素细胞中表达较弱，而在其它3株不同生长期黑素瘤细胞中均有不同程度的高表达，表达强度在各株黑素瘤细胞之间有一些差异，但在不同生长期恶性黑素瘤细胞中并未呈现动态的变化趋势。我们认为，Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路在黑素瘤细胞中被激活，可能参与了恶性黑素瘤的发生、侵袭和转移过程。实验二激光共聚焦扫描显微镜检测正常黑素细胞和不同生长期黑素瘤细胞中的Ca²⁺浓度本实验运用激光共聚焦扫描显微镜检技术，检测了皮肤正常黑素细胞和分别来源于原位、侵袭性和淋巴结转移的WM793B、LIBR、SK-MEL-5恶性黑素瘤细胞系中的Ca²⁺浓度。结果显示：在皮肤正常黑素细胞中Ca²⁺浓度较低，而在其它3株不同生长期黑素瘤细胞中Ca²⁺浓度均有不同程度的升高，荧光强度在各株黑素瘤细胞之间有一定差异，但在不同生长期恶性黑素瘤细胞中并未呈现动态的变化趋势。黑素瘤细胞中Ca²⁺浓度的增高提示Ca²⁺的浓度变化可能参与了黑素瘤细胞的侵袭、转移过程，可能在Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路调控黑素瘤的发生、发展中具有关键作用。实验三免疫组化检测NFAT和Calcineurin在色素痣及原位、侵袭性和转移性黑素瘤组织标本中的表达本实验采用免疫组织化学染色方法，检测了色素痣标本（30例）以及原位、侵袭性和转移性黑素瘤组织标本（各10例）中NFAT2和Calcineurin-B的表达。结果显示：NFAT2蛋白主要表达于胞浆及胞核，而Calcineurin-B主要表达于胞浆。在30例色素痣中两种信号分子的表达皆为阴性，而NFAT2在原位（2例）、侵袭性（8例）和转移性（9例）黑素瘤临床组织标本中呈阳性表达，其在黑素瘤临床组织标本中的阳性表达率为63％，与色素痣的阴性表达具有显著差异（P<0.001）。在侵袭性和转移性黑素瘤临床标本中强阳性表达分别为6例及7例，而原位黑素瘤中无1例为强阳性表达，提示随着肿瘤的发展，其表达有逐渐增强的趋势。Calcineurin-B在色素痣细胞中均为阴性表达，而在原位（3例）、侵袭性（8例）和转移性（9例）黑素瘤临床组织标本中呈阳性表达，阳性表达率在色素痣和黑素瘤之间差异显著（P<0.001）。在侵袭性和转移性黑素瘤临床标本中强阳性表达分别为6例及7例，而原位黑素瘤中也无1例为强阳性表达，其阳性表达率及表达强度与NFAT2一致，提示这两种分子在不同发展阶段的黑素瘤组织标本中的表达具有动态变化过程，Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路可能在黑素瘤的发生、侵袭和转移过程中具有重要作用。综上所述，在分别来源于原位、侵袭性和转移性黑素瘤细胞系中Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin和Vimentin在mRNA和蛋白水平的表达均增高，但并不呈现动态的变化趋势，而正常黑素细胞仅有低表达；黑素瘤细胞内Ca²⁺浓度也较正常黑素细胞明显增高，黑素瘤组织标本中NFAT2和Calcineurin-B的表达明显增强，且呈现出在侵袭性和转移性黑素瘤较原位黑素瘤表达更强的趋势，而且这两个分子的阳性表达率和表达强度具有一致性，提示Wnt5a/Ca²⁺/Calcineurin/NFAT信号通路在黑素瘤中被激活，可能在黑素瘤的侵袭、转移中具有重要作用。