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疟疾是严重危害人类健康的重要传染病,与艾滋病、结核病一起被列为全球3大公共卫生问题。媒介控制是疟疾综合防治措施的重要组成部分,有效的的媒介调查要求准确把握按蚊的易感性、种群密度、嗜血习性、寿命、杀虫剂抗性及子孢子感染等情况。按蚊是传播疟疾的惟一媒介,检测按蚊体内疟原虫子孢子不仅是媒介调查的重要内容,而且有助于了解疟疾流行情况和评价疟疾控制效果,对疟疾防治策略的制订具有重要意义。传统的按蚊唾液腺解剖镜检方法不仅费时、费力,且检测效率很低;近年来,聚合酶链式反应(PCR)已应用到蚊体内疟原虫的检测上,但是PCR技术需要特殊仪器设备且检测成本较高。因此,在疟疾防治和媒介调查监测中,迫切需要一种成本低廉、简便、快速、敏感和特异的蚊体内疟原虫子孢子检测方法。目的建立一种简便、快速和高敏感度的检测蚊体内间日疟原虫子孢子的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法通过基因多序列比较和blast比对,找出间日疟原虫环子孢子蛋白基因保守序列,然后针对种属特异性保守区域的6个位点设计2对引物,通过对反应体系(包括Mg2+、dNTPs、betaine、FIP/BIP、F3/B3等浓度)和反应条件(包括反应温度和反应时间)的优化,建立蚊体内间日疟原虫子孢子的LAMP检测法;以质粒DNA,阴性按蚊、恶性疟原虫及正常人血DNA为模板,同时以水为模板做空白对照来评价LAMP检测特异性;将间日疟原虫CSP基因质粒DNA梯度稀释,并与阴性按蚊DNA按1.0μL加1.3×106、1.3×105、1.3×104、1.3×103、1.3×102、1.3×101、1.3×100拷贝混合后为模板进行LAMP反应,观察其检测敏感性;将感染性阳性按蚊与阴性按蚊DNA作1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256稀释,然后以稀释样本为模板进行LAMP反应,观察其检测敏感性;再用此方法与镜检解剖、巢式PCR同时检测同一批次人工体外饲血感染的67只按蚊,采用SPSS16.0作卡方(χ2)分析,评价其应用价值。结果反应体系和反应条件的优化结果表明,当采用8 mM Mg2+、1.4 mM dNTPs、0 M betaine、1.6μM FIP/BIP和0.2μM F3/B3反应体系,65℃反应70 min即可完成检测;此法检测质粒DNA阳性,对照组均为阴性;检测不同比例稀释的间日疟原虫CSP基因质粒DNA与按蚊DNA混合物,最低可检测1.3×102拷贝的间日疟原虫CSP基因质粒DNA与按蚊DNA的混合物;检测不同比例感染按蚊与阴性按蚊DNA混合样本,最低可检测出1:128稀释样本;用此法检测67只同一批次人工感染的按蚊,采用SPSS 16.0统计分析,LAMP阳性检出率为47.76%,显著高于镜检解剖阳性率(25.37%),两者差别有统计学意义(χ2=7.24,P<0.01);LAMP阳性检出率高于与巢式PCR(40.30%),但两者差别无统计学意义(χ2=0.73,P>0.05)。结论本研究建立的蚊体内间日疟原虫子孢子LAMP检测法,简便、快速、敏感性高、成本低,进一步优化、完善和推广后有望应用于现场蚊媒内间日疟原虫子孢子的检测。