背景:铁是人体内最丰富及维持机体生命活动必需的微量元素之一,在DNA的合成、电子传递、氧运送等生命代谢过程中起着重要的作用。正常细胞铁代谢处于一个不断吸收、利用、储存、循环的动态平衡中,即铁稳态,其在维持细胞的正常生理功能中具有重要意义。当细胞中铁稳态遭到破坏,就会导致细胞内铁过载。过量的铁通过芬顿（Fenton）反应产生活性氧可以诱导细胞发生一种不同于凋亡、自噬、坏死的程序性细胞死亡方式——铁死亡。其机制为细胞内的谷胱甘肽（GSH）耗竭,谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性下降,脂质氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原反应进行代谢,继而二价铁离子以Fenton反应的方式氧化脂质并产生大量活性氧,促使细胞发生铁死亡。肿瘤细胞为了满足自身不断生长繁殖的需要,在分裂周期中需要合成并积累大量与DNA合成,DNA复制及DNA修复相关的酶系。铁作为DNA聚合酶和染色体稳定性相关的修复酶的活性中心构成元素,是DNA合成过程中的主要限速因素。高水平铁代谢是肿瘤细胞主要的表现之一,因此,铁元素对肿瘤的生长,生存及转移具有重大潜在意义。放射治疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一。有研究提出射线可能诱导肿瘤细胞铁死亡的机制:射线可以激活ATM,并协同抑制谷氨酸-胱氨酸转运体Xc-的单位SLC7A11,导致胱氨酸摄取减少,增强肿瘤脂质氧化和铁死亡,达到杀伤肿瘤细胞的目的。随后陆续有研究表明射线可以通过诱导铁死亡所需的脂质代谢酶ACSL4的表达,导致脂质过氧化和铁死亡,下调ACSL4表达则可以抑制铁死亡,导致肿瘤细胞出现放射抵抗性。同时射线还诱导了SLC7A11和GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）的表达,用铁死亡诱导剂（FINs）下调SLC7A11或GPX4表达可提高放射抵抗性肿瘤细胞和和异种移植瘤的放射敏感性。此外,铁死亡与接受放射治疗患者良好预后相关。这些研究结果表明铁死亡可能是放射线杀伤肿瘤细胞的重要途径,诱导铁死亡的发生可以成为提高放射治疗疗效敏的研究新方向,但铁死亡的发生机制以及射线诱导铁死亡的机制通路仍有待发掘。食管鳞癌是最常见的恶性肿瘤之一,放射治疗是食管癌的主要治疗方式之一,但预后不佳,如何提高食管癌放射敏感性一直是食管癌放射治疗研究的重点领域。有研究发现食管鳞癌组织中HSPB1的阳性表达率高于正常食管组织。HSPB1的表达与淋巴结转移有关。故推断HSPB1在食管鳞癌的发生发展中起一定作用,可作为ESCC的预后因素。作为近年来肿瘤治疗的新方向,铁死亡与食管癌的关系并不清楚。研究发现食管癌组织中过表达DNAJB6a在体外和体内均显示出抑瘤作用。其机制可能为DNAJB6a抑制了Gpx4和磷酸化AKT（p-AKT）蛋白的表达,从而促进了铁死亡的发生。故推断DNAJB6在食管癌铁死亡发生发展过程中起重要的抗癌作用。因此,本研究欲探讨是否可以通过诱导食管癌细胞的铁死亡从而上调食管癌放射敏感性并探究其相关机制。热休克蛋白家族B成员1（HSPB1,小鼠HSP25,人HSPB1）是组成性表达于多个细胞或组织中的HSPs成员,在多种肿瘤中呈高表达,其是在热休克或其它化学刺激下诱导的一种不依赖ATP的分子伴侣。HSPB1具有抑制细胞凋亡等细胞程序性死亡的作用。近年来有研究发现HSPB1参与细胞铁死亡过程,但其如何影响肿瘤细胞铁死亡的机制尚不明确。研究方法:1、收集自2014至2016年在中国医科大学附属第一医院接受三维适形或调强放疗的食管鳞癌患者共53例。所有患者在治疗前均由纤维胃镜穿刺取病理,组织标本均以10%福尔马林固定,石蜡包埋封存,并经HE染色病理确诊。治疗方法采用直线加速器6MV-X线三维适形或调强放射治疗,60-66Gy/30–33次,2Gy/次,5次/周。患者生存时间始点为放射治疗的开始日期,每3-6个月门诊或者电话随访1次,收集患者的存活情况,死亡时间及原因。随访截止点为患者出现死亡,失访或至随访截止时间2016年12月。利用免疫组织化学染色两步法测定食管鳞癌活检组织切片中HSPB1和SLC40A1的表达情况。采用SPSS20.0统计学软件进行统计学处理。使用2检验比较计数资料,使用Kaplan-Meier法估算生存率,生存差异用logrank检验,预后因素检验采用COX模型,P＜0.05有统计学意义。2、体外培养食管鳞癌细胞系KYSE150和TE1,通过慢病毒转染sh RNA,经嘌呤霉素筛选获得稳定沉默HSPB1的食管癌细胞系。体外细胞照射方法为细胞常规体外培养至对数生长期时,采用6MV的X射线照射,剂量率为300c Gy/min。根据具体实验采取不同照射剂量。照射后继续培养或给予相应处理。Real-time PCR方法分析细胞中HSPB1基因m RNA表达水平,蛋白免疫印迹（Western blot蛋白检测分析）方法检测细胞中相关蛋白表达情况。通过铁离子试剂盒检测细胞内铁浓度。C11Bodipy探针和流式细胞术检测细胞内脂质ROS水平。采用克隆形成实验评估不同照射剂量下不同处理细胞克隆形成率,使用Graph Pad Prism 7软件通过单击多靶模型Y=1-（1-exp（-k*x））^N,拟合细胞存活曲线,得到k和N值,再根据公式k=1/D0,ln N=Dq/D0,增敏比SER=D0（对照组）/D0（实验组）,求得细胞的平均致死剂量D0,准阈剂量Dq和放射增敏比SER的值。使用SPSS 20.0及Graph Pad Prism软件对实验数据进行分析。所有的实验结果均由重复至少三次实验所得。实验数据以平均值（Mean）±标准差（SD）的形式进行展示。两组均数比较时先进行正态性检验及方差齐性分析,如数据正态分布且方差齐性,采用t检验对两组之间的差异进行统计学比较;如方差不齐,则采用秩和检验。P＜0.05时表示差异具有统计学意义。3、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）方法检测蛋白相互作用,应用免疫组化方法分析食管鳞癌病理组织切片,检测HSPB1与SLC40A1协同表达情况。采用Spearman等级相关性检验相关性。结果:1、HSPB1与SLC40A1表达水平与食管鳞癌患者放射治疗预后相关53例接受单纯放射治疗以及同步放化疗的食管鳞癌患者组织标本中HSPB1高表达有21例,HSPB1低表达有32例,SLC40A1高表达有8例,SLC40A1低表达有45例。HSPB1和SLC40A1表达水平与患者临床病理因素相关性的分析结果显示:HSPB1表达水平与食管鳞癌患者的肿瘤T分期和临床分期相关（P＜0.05）,SLC40A1表达水平与食管鳞癌患者的肿瘤T分期相关（P＜0.05）。经Kaplan-Meier生存分析发现,HSPB1高表达患者较低表达患者预后差,SLC40A1高表达患者较低表达患者预后差。采用Cox比例风险回归模型分析结果显示食管鳞癌患者的HSPB1和SLC40A1表达情况与预后相关（P＜0.05）,是接受放疗的食管鳞癌患者的独立预后因素。2、沉默HSPB1后食管鳞癌细胞铁死亡水平增加通过细胞内铁离子浓度和脂质ROS水平的检测,在给予照射剂量8Gy后,沉默HSPB1基因的细胞铁离子浓度和脂质ROS水平明显较NC组高,有统计学差异（P＜0.05）,表明下调HSPB1表达可以提高食管鳞癌细胞内铁死亡水平。3、沉默HSPB1后食管鳞癌细胞放疗敏感性增加通过克隆形成实验可见经不同剂量射线照射后,沉默HSPB1基因的细胞放疗敏感性增加（P＜0.05）。通过单击多靶模型Y=1-（1-exp（-k*x））^N,拟合细胞存活曲线及相关参数可发现,沉默HSPB1基因的细胞在接受2Gy照射时细胞存活率明显下降,并且准阈剂量也明显增高（P＜0.05）,这表明沉默HSPB1后食管鳞癌细胞放疗敏感性增加。4、HSPB1靶向药KRIBB3可通过增加食管鳞癌细胞铁死亡水平进而增加放疗敏感性通过细胞内铁离子浓度和脂质ROS水平的检测,在给予照射剂量8Gy后,经过KRIBB3处理的细胞铁离子浓度和脂质ROS水平明显增高,有统计学差异（P＜0.05）,表明HSPB1靶向药KRIBB3可以提高食管鳞癌细胞内铁死亡水平。通过克隆形成实验可见经不同剂量射线照射后,经过KRIBB3处理的细胞放疗敏感性增加（P＜0.05）。通过单击多靶模型Y=1-（1-exp（-k*x））^N,拟合细胞存活曲线及相关参数可发现,经过KRIBB3处理的细胞在接受2Gy照射时细胞存活率明显下降,并且准阈剂量也明显增高（P＜0.05）,这表明HSPB1靶向药KRIBB3可增加食管鳞癌细胞放疗敏感性。5、HSPB1在食管鳞癌细胞系中通过调控SLC40A1进而调控铁死亡通过Western blot实验发现沉默HSPB1后食管鳞癌细胞中铁重链蛋白和SLC40A1蛋白也随之下降,表明HSPB1可能通过调控SLC40A1的表达调控细胞内铁离子水平,进而调控铁死亡。SLC40A1+质粒过表达回复实验表明沉默HSPB1后过表达SLC40A1可一定程度下调食管癌细胞铁死亡水平。6、免疫共沉淀证明HSPB1和SLC40A1在细胞内存在直接作用COIP结果发现:在食管鳞癌细胞系中,当用磁珠将HSPB1蛋白拉下沉淀时,Western blot也可以检测到SLC40A1蛋白,说明HSPB1与SLC40A1之间存在生理性相互作用。7、HSPB1与SLC40A1在食管鳞癌组织中呈正相关表达收集经病理诊断为食管鳞癌组织标本,经石蜡切片免疫组化染色和评分标准划分。采用Spearman等级相关性检验发现HSPB1和SLC40A1表达水平存在显著正相关关系（P＜0.05）,二者协同表达。结论:1、HSPB1表达情况与接受放射治疗的食管鳞癌患者预后相关,HSPB1高表达者放射治疗预后差。HSPB1可以作为食管鳞癌患者独立预后因素。2、下调HSPB1表达增加了食管鳞癌细胞系铁死亡水平,从增加了放射敏感性。3、HSPB1通过直接与SLC40A1蛋白相互作用影响铁离子代谢,参与铁死亡过程。4、HSPB1可能成为食管癌放射治疗潜在增敏靶点,HSPB1靶向抑制剂KRIBB3可作为食管癌放射治疗潜在用药。