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第一部分NRF2在NAFLD病人及NAFLD、胰岛素抵抗动物及细胞模型中的表达目的:探索NRF2在NAFLD病人和NAFLD、胰岛素抵抗动物细胞模型中的表达,了解NRF2与NAFLD和胰岛素抵抗的关系。方法:分别采用实时定量PCR技术(qPCR)和蛋白免疫印迹法检测普食组C57雄性小鼠(ND-WT,20周龄)、高脂组C57雄性小鼠(HFD-WT,8周龄开始高脂饮食喂养,共喂养12周)、db/m普食组(20周龄)、db/db普食组(20周龄)、NAFLD病人肝脏及HepG2细胞(牛血清白蛋白和棕榈酸处理24h)中NRF2 mRNA和蛋白的表达情况。结果:在NAFLD病人和NAFLD、胰岛素抵抗动物细胞模型中,NRF2 mRNA和蛋白含量均显著升高。结论:在NAFLD病人及NAFLD、胰岛素抵抗动物及细胞模型中的表达均发现NRF2表达显著升高,而目前尚不清楚这种升高是由于体内糖脂代谢异常所导致的代偿性反应还是因为NRF2的升高导致体内糖脂代谢异常,因此需要进一步的深入研究。第二部分NRF2对肝脏糖脂代谢影响的体内研究目的:探讨饮食诱导下Nrf2基因敲除对小鼠糖脂代谢的影响。方法:选取8周龄雄性野生型(WT)小鼠和Nrf2全身敲除型(Nrf2-/-)小鼠各60只,根据不同饮食喂养类型随机分为4组:WT小鼠普食喂养组(ND-WT组)、WT小鼠高脂饮食喂养组(HFD-WT组)、Nrf2-/-小鼠普食喂养组(ND-Nrf2-/-组)、Nrf2-/-小鼠高脂饮食喂养组(HFD-Nrf2-/-组),分别对各组小鼠进行饮食干预12周和24周,喂养期间每周定时检测体重。于基线、12周末和24周末行IPGTT、IPITT、IPPTT及鼠尾血压监测试验;于造模12周末进行高胰岛素正葡萄糖钳夹试验并取血检测血脂、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)等指标,从而评价Nrf2基因敲除对机体葡萄糖、血脂代谢及血压的影响。结果:基线时,WT组小鼠和Nrf2-/-组小鼠体重没有差异,IPGTT、IPITT、IPPTT显示在各负荷状态下两组小鼠血糖变化没有显著差异。饮食诱导造模12周时,与HFD-WT组小鼠比较,HFD-Nrf2-/-组小鼠体重、GTT曲线下面积、ITT曲线下面积、PTT曲线下面积、钳夹时肝糖生成率(HGP)、TG、TC、FBG、FINS均显著增加,钳夹时葡萄糖输注率(GIR)、葡萄糖消失率(GRd)、肝糖抑制率等明显降低,而普食喂养组未出现上述变化。饮食诱导造模24周时,高脂组和普食组出现与上述变化趋势相似的结果。造模12周和24周时,分别与ND-WT和HFD-WT组小鼠比较,ND-Nrf2-/-和HFD-Nrf2-/-组小鼠鼠尾血压没有显著差异。结论:高脂饮食诱导下Nrf2基因敲除可导致小鼠胰岛素抵抗、葡萄糖、血脂代谢紊乱,而对血压没有显著影响。第三部分NRF2调控肝脏糖脂代谢的分子机制目的:观察Nrf2基因敲除对糖脂代谢及胰岛素信号通路的影响,探讨NRF2参与肝脏糖异生的分子机制。方法:采用qPCR法检测各组小鼠肝脏组织、小鼠原代肝细胞(MPHs)、Nrf2质粒过表达HepG2模型细胞中糖脂代谢相关基因mR NA相对表达水平。Western blot检测各组小鼠肝脏组织中胰岛素受体(IR)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、葡萄糖转运体2、4(GLUT2、GLUT4)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、AMP依赖的蛋白激酶α(AMPKα)、过氧化物酶增殖物激活受体γ协同激活因子1-α(PGC1α)、腺苷反应元件结合蛋白(CREB)及其对应的磷酸化蛋白表达水平。Nrf2过表达质粒转染AMPKα-/-小鼠原代肝细胞,并在棕榈酸干预后检测CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表达水平。采用AMPKα激动剂AICAR预处理WT和Nrf2-/-小鼠原代肝细胞,并在棕榈酸干预后检测CREB、CRTC2、PEPCK、G6Pase表达水平。结果:高脂饮食或棕榈酸干预时Nrf2基因缺失促进肝脏糖异生基因PEPCK、G6Pase mRNA表达,对肝脏糖原代谢及糖酵解相关基因表达没有显著影响;使调节糖异生关键基因转录的辅激活因子CRTC2表达增加,对PGC1α没有影响。Nrf2过表达可抑制糖异生基因PEPCK和G6Pase mR NA的表达。高脂饮食诱导和棕榈酸干预情况下Nrf2缺失能使脂代谢主要相关基因mR NA表达水平升高,而Nrf2过表达抑制脂代谢相关基因mR NA表达。普通饮食喂养下,胰岛素信号通路主要成员及AMPKα、CREB、CRTC2、PGC1α等表达均无差异。与HFD-WT组比较,HFD-Nrf2-/-组小鼠肝脏组织p-IR、p-AKT蛋白表达水平显著降低,p-GSK3β、GLUT2、GLUT4、PGC1α蛋白表达水平无差异,PEPCK、G6Pase和CRTC2表达水平显著增加,p-AMPKα蛋白表达水平显著降低,p-CREB蛋白表达水平显著增加。AMPKα激活后可抵抗棕榈酸干预时NRF2缺失导致的糖异生基因表达增加,AMPKα敲除小鼠原代肝细胞中NRF2过表达不能降低糖异生相关基因的表达。结论:高脂饮食诱导时Nrf2基因敲除能降低肝脏的胰岛素敏感性,促进肝脏糖异生关键基因表达,而Nrf2对肝糖异生的调控作用依赖于AMPKα。高脂饮食诱导时Nrf2基因敲除能升高肝脏胆固醇合成和外排、脂肪酸合成、脂肪酸摄取和脂肪酸β-氧化相关关键基因表达。