树突状细胞(DC)是目前发现的体内功能最强，也是唯一能激活初始型T淋巴细胞的抗原递呈细胞(APC)，它启动并调控维持机体免疫反应。近年随着人们对DC生物学特性了解的深入，DC疫苗的肿瘤免疫治疗方法越来越受到关注。然而，尽管DC疫苗在体外能引起较强的特异性抗肿瘤活性，但在临床实验中，效果却远远未尽人意。所以很有必要继续深入开展以DC疫苗为主的肿瘤免疫治疗的研究工作。 DC疫苗的临床疗效受多种条件所制约。IDO是一种细胞内含亚铁血红素的酶，是肝脏以外唯一可催化色氨酸分子中吲哚环氧化裂解，从而沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶。它在人和动物的组织和细胞中特别是在抗原提呈细胞(APC)和胎盘组织中广泛表达。健康人工DO的表达水平低，但在感染、炎症和细胞因子的作用下其表达可显著增加。过去认为，IDO通过降解必需氨基酸色氨酸浓度使局部形成色氨酸缺乏的微环境，从而抑制病毒、细菌等病原体的增殖。最近的研究表明，工DO除了抵御病原体的侵袭外，还参与肿瘤免疫耐受的产生。多项研究表明，T细胞对色氨酸水平特别敏感，在色氨酸浓度较低时，T细胞的分裂会静止在G1期，停止克隆性增殖。因此推测，IDO可能通过降低机体微环境中色氨酸的浓度，干扰旨在产生对肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的肿瘤免疫治疗作用。由于IDO在肿瘤细胞和APC中广泛存在，IDO已成为肿瘤免疫治疗研究中的一个新靶点，而关于IDO的特异性抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)抗肿瘤作用的研究也提上了日程。单用1-MT已被证实能明显抑制移植性荷瘤小鼠中肿瘤的生长，但不能使之消退；而1-MT联合化疗药物紫杉醇治疗乳腺癌小鼠的研究发现，1-MT能够加强小鼠对肿瘤的免疫反应，提示IDO抑制剂可能在化疗的微环境中减弱肿瘤免疫耐受；另外有学者提出，用于制备疫苗的DC在体外扩增、成熟过程中表达IDO，提示IDO可能也参与了对免疫治疗抗肿瘤作用的调节。然而，1-MT与其它肿瘤免疫治疗方法联合应用的研究，尚未见报道。故此，本实验尝试将工DO的特异性抑制剂1-MT与DC肿瘤疫苗联合应用，考察其能否增强DC疫苗的抗肿瘤作用。 本研究分为4个部分： 第一部分：兔抗人IDO抗体的制作 运用分子克隆的方法，将编码人IDO的全长cDNA克隆入带His标签的表达载体pET30a(+)，构建重组表达载体pET30a(+)-IDO，测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达目的蛋白His-IDO：用纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔抗人IDO多克隆抗体；用Western blot检测该多克隆抗体与重组蛋白His-IDO的反应性，检测抗体的效价。结果显示，His-IDO融合蛋白可与抗His多克隆抗体特异结合，且大小与文献报导的IDO分子量相符；所得兔抗人IDO多克隆抗体的效价高，特异性好，为进一步检测肿瘤细胞和组织标本中IDO蛋白的表达，提供有力工具。 第二部分：人肿瘤细胞IDO的表达对T细胞活力的影响的体外研究 利用免疫印迹(Western blot，WB)方法检测多种人肿瘤细胞系，包括SW1990，HeIa，MOLT-4，A431，MDA-MB-435s，CNE2，HepG2，Jurkat，MDA-MB-231等的IDO表达水平。结果显示，在没有IFN-γ作用下，所有测试细胞均不表达IDO，而在IFN-γ作用18-24h后，在SW1990，Hela，A431，MDA-MB-435s，CNE2，HepG2细胞中检测到IDO的表达，而MOLT-4，Jurkat，MDA-MB-231细胞仍然检测不到IDO的表达。然后，为了探讨IDO的表达对于鼻咽癌肿瘤免疫治疗效果的影响，选用鼻咽癌CNE2细胞作为细胞模型，通过WB检测IFN-γ对IDO表达的诱导情况，用高效液相色谱法(HPLC)检测CNE2培养液中色氨酸的浓度变化，分析IFN-γ诱导CNE2细胞IDO表达和活性增高的剂量和时间效应。采用IFN-γ处理过的CNE2的培养基来进一步培养用ConA激活或未激活的T细胞，通过Annexin v流式细胞术检测细胞凋亡情况，考察这种模拟体内肿瘤微环境，即低色氨酸浓度环境，对T细胞的凋亡程度的影响，并考察1-MT的可能作用。结果显示，在CNE2细胞条件培养基中，激活的T细胞的增殖率明显低于未激活的T细胞(p<0.05)，激活的T细胞的凋亡率(21.46％)几乎是未激活的T细胞(12.43％)的两倍，加入1-MT能提高T细胞的增殖率，降低T细胞的凋亡率。这提示相对于未激活的T细胞，激活的T细胞对IDO高表达导致的色氨酸耗竭的肿瘤微环境(tumor microenvironment)更敏感，凋亡程度更高。用RT-PCR检测不到CNE2细胞内含有Epstein-Barr病毒(EBV)基因组编码的具有免疫抑制作用的病毒白细胞介素10(IL-10)。这提示我们，IDO介导的激活型的T细胞的抑制作用很可能是肿瘤免疫治疗效果不佳的原因之一。 第三部分：树突状细胞中IDO的表达及其调控的相关研究 按照经典的细胞因子培养法，在体外联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和促成熟因子肿瘤坏死因子(TNF-α)培养C57BL/6小鼠骨髓源DCs(BM-DCs)，利用流式细胞技术检测培养7天的BM-DCs表型，结果显示基本符合成熟BM-DCs的表型特点。利用WB技术检测BM-DCs内IDO的表达情况，发现用TNF-α促成熟的DCs并不表达IDO，而加入IFN-γ作用18-24h的DCs内可检测到IDO的表达，说明IFN-α能诱导成熟DCs表达IDO。为了探讨表达IDO的DCs对同种T细胞增殖的作用，我们分别将IFN-γ作用或未作用的成熟DCs与同种小鼠未激活的或用anti-CD3激活的脾脏T细胞按1：20比例混合后，进行单向混合淋巴细胞实验反应(MLRs)。[<3>H]掺入实验结果显示，相比于未用IFN-γ作用过的DCs来说，IFN-γ作用过的DCs明显抑制T细胞的增殖的能力，而这种抑制作用在激活的T细胞体系中更明显，后者增殖率下降了60％；在MLRs体系加入lMT可部分抵消这种抑制作用，使激活的T细胞增殖率恢复到71％，从而提示DC可以通过产生IDO来降解微环境中色氨酸，发挥着抑制激活的T细胞增殖的作用。结果表明，DC本身并没有IDO的表达，但在IFN-γ刺激下可产生IDO，产生IDO的DC能抑制激活型T细胞的增殖，而激活型的T细胞又是免疫反应中IFN-γ的主要来源。这些结果提示IDO可能在复杂的DC与T细胞相互作用的负反馈调节机制中发挥一定的作用，即DC通过表达。IDO抑制激活型T细胞的免疫反应，从而导致免疫耐受。 第四部分：IDO抑制剂1-MT对DC疫苗体内抗肿瘤作用的影响 利用wB和免疫组化(IHC)分析方法，检测Lewis肺癌小鼠中肿瘤组织和淋巴结组织内IDO的表达情况。结果显示，Lewis肺癌细胞(LLC)在体内、外均不表达IDO；但IHC检测发现有少量表达IDO的单核细胞浸润于肿瘤组织内；此外，IHC分析还发现肿瘤引流淋巴结中(TDLNs)中，有大量表达IDO的单核细胞聚集，推测这些跟肿瘤组织中类似的单核细胞可能是巨噬细胞和DCs等APCs。这些结果说明，虽然LLC并不表达IDO，但在荷瘤小鼠的TDLNs的APCs内却有IDO的表达。鉴于TDLNs内APCs在肿瘤抗原呈递和激发免疫反应中的关键地位，推测TDLNs中IDO的高表达在整体免疫耐受中也起着重要的作用。 除了肿瘤细胞引起TDLNs内APC高表达IDO之外，我们还首次发现，在正常动物体内，用灭活的DC/LLC融合细胞疫苗免疫后的小鼠脾脏内，同样可以检测到IDO的表达。DC/LLC融合细胞疫苗(简称DC疫苗)是用聚乙二醇(PEG)化学法制作的DC和LLC融合细胞，融合率约为22.1％，灭活后对小鼠进行免疫。利用WB和IHC分别检测DC/LLC融合细胞以及灭活疫苗免疫动物后脾脏组织内IDO的表达情况。结果发现，DC/LLC融合细胞在体外并不表达IDO，但在免疫的动物脾间质内，却发现了表达IDO的单核细胞。推测免疫个体可能通过表达IDO来下调免疫反应，以避免由于DC疫苗引起过强反应而可能带来的对机体的损伤，即所谓的反向调节(Counter-Regulation)机制。推测它和肿瘤细胞引起TDLNs内IDO高表达一起，共同影响了肿瘤疫苗的治疗效果。于是，我们尝试在DC疫苗治疗方案中加入IDO的抑制剂1MT(联用组)，并通过定期观察和测量，比较联用组与DC疫苗单用组的抗肿瘤效果。实验结果显示，联用组的体积抑瘤率(63.1％)显著高于DC疫苗单用组(37.3％，p<0.05)和1MT组(27.0％，p<0.05)，小鼠的生存期长于DC疫苗单用组和1MT组；通过乳酸脱氢酶实验(LDH)发现，联用组激发脾脏细胞毒性T细胞(CTL)的杀伤率(29.36±2.36)明显大于DC疫苗单用组(19.33±2.37，p<0.05)。 以上结果提示，通过特异性抑制由肿瘤细胞本身导致和免疫治疗继发性产生的免疫微环境中IDO的活性，1-MT有望为一些以激发特异性T细胞为宗旨的肿瘤免疫治疗提供了一个良好的免疫微环境，从而增强其体内抗肿瘤作用。