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Exendin-4是从希拉毒蜥唾液中分离的一种多肽激素,由39个氨基酸残基组成,与胰高血糖素样肽1(GLP-1)有53%的同源性,是GLP-1受体激动剂,与GLP-1类似,Exendin-4可调节血糖浓度,但GLP-1的半衰期仅有2min,而Exendin-4半衰期却长达9.57h,因此在治疗2型糖尿病方面具有广阔的前景。
本文对重组大肠杆菌(BL21(DE3)-pET-32a(+)-Exendin-4)表达条件和发酵工艺进行了系统的研究。确定出最佳培养基组成为2×YT。对三角瓶发酵条件的优化采用单因素实验法与正交试验法,研究了温度、接种量、诱导时机、诱导剂浓度、诱导时长和MgSO4浓度等对重组菌生长和表达的影响,确定了最佳发酵条件为:温度32℃、接种量3%、诱导时机为菌体对数生长期的中后期(OD600值达到1.5左右)、乳糖浓度0.1 g/L、诱导时间9h。采用优化后的培养条件,发酵13h,菌体密度OD600值达到2.5,菌体湿重约为10g/L,表达量占菌体总蛋白的30%,每升发酵液可以得到0.11g目的蛋白。利用自然筛选法获得了抗噬菌体的重组大肠杆菌菌株,其初代抗性菌株的生长和表达效果与非抗菌株没有显著差异,只是在多次传代后表达效果显著降低。在10L发酵罐中采用分批和分批补料的方法发酵带有噬菌体抗性的重组大肠杆菌(BL21(DE3)-pET-32a(+)-Exendin-4),对其发酵工艺进行了探索,最终分批发酵19h,菌体密度OD600值达到5.28,菌体湿重11.91g/L,表达量约占总蛋白量的30%,每升发酵液得到0.24g目的蛋白;分批补料发酵31h,菌体密度OD600值达到32.25,菌体湿重110.55g/L,表达量约占总蛋白量的10%,每升发酵液得到0.83g目的蛋白。