目的:慢性脑低灌注状态是是血管性痴呆(vascular dementia, VD)、Alzheimer’s病(AD)和Binswanger病等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。在我国,VD是老年期痴呆的主要组成部分。VD不仅严重损害患者的健康,也给社会和家庭带来沉重的负担。目前,VD的发病机制尚不十分清楚,也无特殊有效的治疗方法,因此探讨VD的发病机理,制定合理的治疗方案,是医学领域研究的重要课题。目前认为慢性脑低灌注是VD的主要原因。有研究表明,在低灌注状态及低代谢状态下认知功能可发生减退,而脑部自由基代谢的紊乱是低灌注时产生脑实质和脑微血管系统损害的重要的可能机制。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)作为体内清除超氧阴离子的特异酶,其变化间接反应了体内清除自由基的能力变化。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是脂质过氧化反应的代谢终产物,间接反应了体内自由基损伤引起的脂质过氧化反应的强弱。脑缺血后脂质过氧化活跃,MDA产生增多,SOD则因消耗增多而减少。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)是近几年发现的参与调节氧稳态失衡的一个核心调节因子,在低氧状况下诱导产生并发挥多方面效应。有研究表明,HIF-1α可能参与了慢性低灌注大鼠的代偿与适应机制。依达拉奉作为一种氧自由基清除剂对急性脑缺血的神经保护作用引起了人们越来越多的关注。但国内外有关依达拉奉神经保护作用的大部分研究都集中在急性缺血模型,有关依达拉奉作用于慢性脑缺血模型的实验研究报道尚缺乏。本实验通过模拟人类慢性脑低灌注的大鼠动物模型,观察大鼠学习记忆、前脑组织SOD活力和MDA含量及海马CA1区HIF-1α的表达变化并观察新型自由基清除剂依达拉奉对它们的影响,在揭示了VD发病机制的同时也为临床治疗血管性认知功能障碍提供一个新的思路。方法:雄性SD大鼠84只,月龄3~4个月,体重280~340g,随机分为假手术对照组(n=20),生理盐水组(n=32),依达拉奉组(n=32)。各组又随机分为6周组和8周组。生理盐水组和依达拉奉组大鼠按照de la Torre等[1]方法,行双侧颈总动脉永久结扎术,假手术组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外,余处理同生理盐水组和依达拉奉组。依达拉奉组手术第4周后腹腔注射依达拉奉5mg·kg-1·d-1,六周组共注射2周,八周组共注射4周,生理盐水组腹腔注射等剂量生理盐水。各组大鼠术后分别在各时间点水迷宫测试后断头在冰盘上快速取脑,去除脑干及小脑,置0~4oC生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干。视交叉后1mm及4mm冠状切开脑组织,取中间切块为海马组织,系列固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片,行HE染色和免疫组化染色观察海马病理变化和HIF-1α表达变化,运用Image-Pro Plus图象分析软件对各组大鼠海马组织CA1区相同面积内HIF-1α阳性细胞测定累计光密度(IOD)。取视交叉前脑组织分别检测SOD活力和MDA含量。运用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析,采用LSD-t检验进行各组间的两两比较,P<0.05表示有统计学意义。结果:(1)各组大鼠存活情况:假手术组(包括6周组和8周组)死亡0只,生理盐水6周组、8周组分别死亡5只、6只,死亡率分别为31.3%和37.5%。依达拉奉6周组、8周组分别死亡5只、4只,死亡率分别为31.3%和25%。各组存活大鼠作为研究对象。(2)水迷宫试验:生理盐水6周组、生理盐水8周组大鼠学习、记忆成绩显著下降,表现为寻找平台潜伏期时间延长,明显高于假手术组(P<0.05),与生理盐水6周组相比,生理盐水8周组大鼠学习、记忆成绩下降更明显(P<0.05)。依达拉奉6周组、8周组分别与生理盐水6周组、8周组比较,学习、记忆成绩均显著改善(P <0.05),与假手术6周组相比,依达拉奉6周组学习、记忆成绩仍有所下降(P<0.05),依达拉奉8周组与假手术8周组相比学习、记忆成绩无显著差别(P>0.05),与依达拉奉6周组相比,依达拉奉8周组学习、记忆成绩有所改善(P <0.05)。(3)海马HE染色:假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞排列较致密整齐,胞浆内尼氏体丰富,核大而圆,核仁明显;相比之下,生理盐水组大鼠海马CA1区锥体细胞排列松散,层次不清,有细胞缺失现象,出现炎性细胞浸润,胞体变小,核固缩,胞质浓染,且8周组较6周组细胞缺失、核固缩现象更明显;依达拉奉组大鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,层次尚清,炎性细胞浸润明显减少,核固缩现象较少见,且8周组较6周组改善更明显。(4)海马CA1区HIF-1α表达变化:假手术组海马CA1区仅见极少量阳性神经元;生理盐水6周组、8周组可见少量阳性神经元,排列松散,胞体变小,核固缩,阳性细胞累计光密度(IOD)值高于假手术组(P <0.05);生理盐水6周组与8周组比较IOD值差异无统计学意义(P <0.05);依达拉奉6周组、8周组海马CA1区均可见有大量HIF-1α阳性神经元分布,阳性物质主要位于胞浆内,胞核也有少量表达,细胞排列较整齐紧密,呈棕黄色,胞体较大,圆形或椭圆形,有的可见突起;与假手术6周组及生理盐水6周组相比,依达拉奉6周组阳性神经元IOD值明显增高(P <0.01);与假手术8周组及模型8周组相比,依达拉奉8周组阳性神经元IOD值明显增高(P <0.01),且亦高于依达拉奉6周组(P <0.05)。(5)SOD、MDA测定结果情况:与假手术组相比,生理盐水6周组、8周组前脑组织SOD活力下降,MDA含量增加(P<0.05)。生理盐水6周组与8周组相比,生理盐水8周组SOD活力下降进一步下降,MDA含量进一步增加(P >0.05);与生理盐水6周组相比,依达拉奉6周组SOD活力有所增加,MDA含量有所下降(P <0.05)。与生理盐水8周组相比,依达拉奉8周组SOD活力明显增加,MDA含量明显下降(P <0.01),且与依达拉奉6周组相比SOD活力亦有所增加,MDA含量有所下降(P <0.05)。结论:(1)本实验成功地建立了慢性脑低灌注大鼠模型(2-VO),水迷宫试验证实了模型大鼠存在学习和记忆功能障碍,海马HE染色显示锥体细胞受损能够基本模拟临床上VD的智能障碍,同时,也证实了依达拉奉的治疗效果。(2)采用免疫组织化学方法,证实了在慢性脑低灌注状态下大鼠海马组织HIF-1α表达增加,可能参与了慢性脑缺血的代偿与适应机制。分别采用黄嘌呤氧化法和硫代巴比妥酸显色法测定2-VO大鼠前脑组织SOD活性及MDA含量,证实了2-VO后脑组织SOD活性下降,MDA含量增加。依达拉奉治疗后大鼠海马组织HIF-1α表达明显增加,前脑组织SOD活性明显增强,MDA含量明显下降,表明依达拉奉可能通过促进HIF-1α表达,抑制黄嘌呤氧化酶和次黄嘌呤氧化酶活性,降低羟自由基的浓度等多种途径改善血管性认知障碍。(3)本试验证实通过延长用药时间,大鼠学习记忆能力得到持续改善,提示临床治疗血管性认知障碍要长期坚持。