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研究目的本研究拟通过动物实验观察Caspase家族成员Capsase3、Capase8、Caspase9及其所介导的凋亡在肿瘤血管生成拟态形成过程中的作用。并通过明胶酶谱和免疫组织化学技术观察药物干预后各组肿瘤组织基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)的活性水平和表达,基因芯片技术检测Caspase3抑制剂组原代细胞差异表达的基因,分析VM形成的分子机制,为临床治疗存在VM的高度恶性肿瘤提供实验依据。研究方法1)建立恶性黑色素瘤动物移植瘤模型,并随机分为Caspase3抑制剂组、Caspase8、Caspase9抑制剂联合组、对照组,待成瘤后每日分别注射Caspase3抑制剂和Caspase8、Caspase9抑制剂。每日测量肿瘤体积绘制生长曲线来观察不同组间肿瘤的生长速度。2)通过免疫组化和组织化学双染的方法观察各组肿瘤组织VM的数量,通过明胶酶谱和免疫组化方法观察各组肿瘤组织MMP-2和MMP-9的活性水平和表达,进一步分析Caspase家族成员对VM形成的影响。3)将Caspase3抑制剂干预后的恶性黑色素瘤细胞和对照组细胞进行原代培养,待细胞达到5×106时提取总RNA。应用18000个克隆的杂交膜进行cDNA微阵列杂交。芯片数据标准化处理后,采用倍数法筛选Caspase3抑制剂组B16原代细胞和对照组B16细胞之间的差异表达基因,阈值为1.0倍。采用DAVID(http://david.abec.nciferf.gov/)在线分析工具,对差异表达基因进行日本京都基因和基因组百科全书代谢通路(KEGG pathway)功能富集。4)通过伤口愈合实验观察Caspase3抑制剂组肿瘤原代细胞与对照组相比迁移能力的变化。研究结果1)与对照组相比,在肿瘤生长早期,Caspase3抑制剂组和Caspase8、 Caspase9抑制剂联合组肿瘤体积的生长速度较缓慢,差异有统计学意义(P<0.05), Caspase3抑制剂组和Caspase8和Caspase9抑制剂联合组肿瘤组织中VM的数量小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2)对照组MMP-2以及MMP-9的活性和表达强于Caspase3抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05),对照组MMP-9的活性和表达强于Caspase8、Caspase9抑制剂联合组,差异有统计学意义(P<0.05)。3)基因芯片数据显示Caspase3抑制后的恶性黑色素瘤细胞有1103个基因差异表达,经DAVID的KEGG pathway分析显示差异表达的探针富集于近200条代谢通路,包括TGF-β信号通路,促分裂原活化蛋白激酶途径,粘着斑通路,细胞周期,谷胱甘肽代谢信号通路,胰岛素信号通路,Wnt信号通路等。4) Caspase3抑制剂组肿瘤原代细胞与对照组相比迁移能力明显下降。结论1)Caspase家族及其介导的凋亡可能参与恶性黑色素瘤VM的形成。2) Caspase3抑制剂可能通过下调肿瘤细胞MMP-2和MMP-9活性及表达,并降低细胞的迁移能力,从而抑制VM的形成。3) Caspase3抑制剂还可能通过下调Id1和Id3的表达抑制VM的形成。4) Caspase3不仅参与了凋亡的过程,还可能参与TGF-β信号通路的信号传递,当抑制Caspase3的表达后,这些信号通路的多个基因出现差异表达。