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最近几年,采用两个低能量光子作为激发光源的双光子荧光显微镜在成像厚的、不透明以及活生物样本时比传统的激光共聚焦显微镜更有优势。双光子显微镜检测灵敏度高,没有图像失真,低光漂白并且能减少光损伤。正是由于双光子显微镜有上述优点,使得生物学家得以在活细胞和活组织中观察和研究生命过程。荧光显微技术与荧光探针是相辅相成、相互促进的,新的荧光显微技术需要新的荧光探针,新的荧光探针促进显微技术发展。随着双光子显微镜的发展双光子荧光探针得到不断发展,但是缺乏专用的具有大的吸收截面的双光子探针限制了双光子荧光显微镜的使用,因此开发新型的双光子荧光探针具有重要意义。细胞内pH在细胞内许多生理过程中起着至关重要的作用,包括细胞代谢、信号转导、酶活性、离子转运、细胞的生长、增殖、凋亡以及自我吞噬。细胞内pH值的异常可能会导致细胞器功能障碍,许多疾病与此相关,如癌症、中风、阿耳茨海默氏疾病。因此,成像和定量测量活细胞内的pH值对于理解细胞生理功能机理是至关重要的。目前,荧光成像技术研究细胞内的pH值相对于微电极、核磁共振波谱以及光学显微镜等方法来说,是一个简单、灵敏、功能强大的工具。然而,仅仅是测量荧光强度的变化(“荧光开”和“荧光关”),往往会受到光漂白、探针浓度、细胞中探针分布不均匀、不同细胞类型、细胞厚度变化、光稳定性、激发光路长度以及其他环境因素的影响。比例荧光成像由于利用同一发射光谱的两个不同的荧光峰做比例,可以消除大部分外部因素的影响,从而实现自校准,因此比例荧光探针可以用于复杂体系检测pH值变化。1、本文设计合成了一种具有高选择性、高膜透性、低毒性、高生物相容性能够用于活细胞和活组织成像并能定量测量活细胞pH值的单/双光子荧光探针。通过Heck反应制备了基于咔唑衍生物有机小分子单/双光子pH比例荧光探针(PCBT),并通过核磁共振、高分辨质谱确定其分子结构。首先通过研究PCBT在不同极性溶剂中的荧光光谱变化,确定其荧光发射是ICT过程,这种荧光发射过程的分子适合作为比例荧光探针。其次,通过研究在酸碱条件下的线性吸收和荧光发射的变化,确定PCBT对于pH值的变化有响应,通过pH滴定实验,在体外验证了PCBT适合作为单/双光子pH比例荧光探针。再次,由于氮原子容易与众多金属离子和阴离子结合,因此我们研究了PCBT对于一些细胞中常见的阴/阳离子的选择性,证明PCBT对于其他离子响应很少,对于H+有非常高的选择性。通过细胞毒性研究表明PCBT对于SiHa细胞具有低毒性,高生物相容性的特点。利用单/双光子激光共聚焦显微镜观察经PCBT染色的SiHa和HeLa细胞,表明PCBT可以用于细胞单/双光子显微成像。DIC图像证明细胞具有完整的细胞结构,贴壁生长,活性良好。通过研究来自于不同光学窗口的荧光图像的比例,证明PCBT可以在单/双光子激发下对细胞内不同区域的pH值比例成像。利用细胞内外pH值平衡以后的细胞通过显微荧光成像得到不同pH值细胞的比例荧光图像,将这些图像与正常细胞比例荧光图像的伪色彩做对比,可以定量测量细胞内pH值。最后研究了活组织染色浓度、染色时间对于双光子荧光成像深度的影响。实验证明PCBT用于肝脏和肾脏活组织切片双光子荧光显微成像深度可以达到66gm和42μm,经过归纳总结得出PCBT用于活组织成像最低浓度不能低于20μM染色时间最好是120分钟以上,提高染色浓度能显著提高成像深度。2、设计、合成了三苯胺和咔唑衍生物(APPI、ECPI)用于定位细胞中的线粒体,通过研究其在不同极性溶剂中的荧光光谱变化,确定其荧光发射是PET过程。研究两个分子在酸碱条件下的发射光谱排除了两个分子对pH值的变化有响应。通过MTT实验研究表明其对于SiHa细胞具有低毒性,高生物相容性的特点。利用单光子激光共聚焦显微镜观察经APPI、ECPI染色的SiHa细胞,得到清晰艳丽的活细胞显微荧光图像。利用MTR和APPI、ECPI复染活SiHa细胞,通过计算得到APPI、ECPI和MTR共定位系数高达0.989、0.995,重合系数高达0.92和0.81,证明APPI、ECPI就是线粒体探针。3、设计合成了基于咔唑和吡啶衍生物的荧光染料,研究其在不同pH值缓冲溶液中的光物理性质。通过MTT实验证明这些分子对于细胞具有低毒性高生物相容性的特点。通过活细胞成像试验说明这些咔唑和三苯胺衍生物均可用于活细胞成像,由于ECP和CP两个分子本身具有双荧光发射,用其来自于不同通道的荧光做了比例成像,结果显示这两个分子能够在活细胞中比例成像,其伪色彩可以成像细胞质中的不同位置,结合分子结构,推测可能与细胞中氢离子分布有关。这些研究为以后利用咔唑和三苯胺衍生物设计活细胞荧光探针打下基础。综上所述,本文成功设计并合成了一种具有高选择性、高膜透性、低毒性、高生物相容性能够用于活细胞和活组织成像并能定量测量活细胞pH值的单/双光子荧光探针。合成了两个能用于细胞内线粒体成像的线粒体荧光探针。最后对基于咔唑和三苯胺衍生物的荧光染料进行了有益的探索。