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目的:探索荧光双重染色诊断双表型肝细胞癌(Dual-phenotype hepatocellular carcinoma,DPHCC)的新方法,初步探讨DPHCC的患者术后早期复发与肝癌干细胞标志物表达相关性。方法:1.建立诊断DPHCC的方法:收集2015年80例HCC患者的术后石蜡标本,用Hep par-1和CK19抗体对80例HCC患者的石蜡切片标本进行标记,用荧光染色间接法分别对Hep par-1和CK19进行荧光标记,Hep par-1用FITC结合的二抗标记为绿色,CK19用TRITC结合的二抗标记为红色,观察红色和绿色荧光重叠(黄色)情况,超过15%的细胞阳性表达重叠(黄色)即诊断为DPHCC;2.用目前诊断DPHCC的金标准免疫组织化学法验证荧光染色诊断DPHCC的准确性:将80例患者的石蜡标本进行连续切片,用免疫组化法对相邻两张切片分别用Hep par-1和CK19抗体进行染色,调整两张切片镜下视野,寻找两张切片Hep par-1和CK19双阳性的部位,综合连续切片的染色结果,双阳性的部位超过视野的15%诊断为DPHCC。比较两种染色方法诊断DPHCC的结果有无差异;3.收集2015年80例HCC患者的临床病理资料,用卡方检验比较组间基线资料差异,Kaplan-Meier法比较两组无瘤生存率,用COX回归模型评价影响HCC早期复发的危险因素;4.从以上80例HCC患者冰冻组织标本中,选择47例标本,根据染色结果分为DPHCC组和非DPHCC组,分别用real-time quantitative PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)比较两组肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)标志物CD90、CD133、EPCAM在基因和蛋白水平的表达是否有差异。结果:1.免疫荧光双重染色效果较好,红色、绿色显色清晰,重叠部分呈黄色,三种颜色在同一张切片中染色对比度较高,在80例HCC中,通过免疫荧光双重染色方法,19例被诊断为DPHCC,19例被诊断为CK19~+HCC,42例被诊断为CK19~-HCC,将未达到DPHCC诊断标准的纳入非DPHCC组;2.免疫组织化学法连续切片染色法图像清晰,对DPHCC的诊断结果与免疫荧光双重染色结果相同;3.DPHCC组和非DPHCC组的各项临床病理资料差异无统计学意义,两组中位无瘤生存时间分别为7个月和16个月,6个月,12个月,24个月无瘤生存率分别为47.4%,36.8%,5.3%和80.3%,63.6%,38.3%,差异有统计学意义(P=0.001)。多因素分析显示AFP>400ng/ml(P=0.013)和肿瘤多结节(P=0.011)是影响HCC复发的独立危险因素;4.qPCR结果显示在DPHCC组中,CD133(P=0.031),EpCAM(P=0.013)在mRNA水平上表达高于非DPHCC组。WB结果显示DPHCC组在Ep CAM(P<0.001)和CD133(P=0.031)的蛋白质表达水平上高于非DPHCC组。而两组间CD90在蛋白表达(P=0.11)和mRNA(P=0.441)表达上差异均无统计学意义。结论:1.免疫荧光双重染色技术可作为科研诊断DPHCC常用方法,较IHC更为直观简便,但临床诊断的应用尚需进一步探讨;2.接受手术切除术的DPHCC患者相比较非DPHCC患者有较高的早期复发率;3.DPHCC患者的癌组织肝癌干细胞标志物EPCAM和CD133的表达高于非DPHCC患者,可能是早期复发的重要原因。