研究背景及目的：　　 自噬(autophagy)是一个在饥饿或应激的状态下，对细胞内大分子物质和细胞器进行降解和再利用的过程。表现为细胞浆中出现大量包裹者细胞浆和细胞器的空泡结构及溶酶体对空泡内成分的降解。自噬不仅具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用，过度激活的白噬也可以导致细胞死亡，然而，自噬在“促进生存”和“诱导死亡”间切换的分子机制，目前尚未完全明了。　　 在自噬的早期研究中，人们以酿酒酵母S.cerevisiae为模型研究其分子机制，所发现的一系列调控基因统一命名为“自噬相关基因”(Atg)，随后在哺乳动物细胞中陆续发现了许多Atg的同源基因，并且这些基因及其产物的功能均高度保守。随着参与自噬的关键分子的鉴定成功，我们对其分子机制、生理功能和在病理过程中的作用都有了进一步的了解。在自噬的启动阶段，参与其信号转导的是classⅢPI3k，它对自噬泡形成的早期至关重要。mTOR也是自噬启动阶段的关键分子，它可以感受细胞内氨基酸和ATP的量从而控制细胞的自噬活性，因而被称为自噬的门控分子。在自噬体膜的延伸过程中，有两个主要的泛素样结合系统，一个是Atg12-Atg5结合系统，另一个是Atg8脂化系统。自噬体膜的延伸有赖于两者的协同作用。而在白噬的成熟阶段，主要是自噬体与溶酶体的融合及自噬体的降解。　　 Beclin1是酵母自噬相关基因Atg6的哺乳动物同源基因，也是第一个被发现的哺乳动物自噬相关基因。对自噬调控的机制研究发现，Atg6可作为Ⅲ型PI3K(Vps34)的变构激活剂，与Vps34、Vps15、Vps38共同组成复合物，参与自噬体的形成。因此Beclin1是一个参与自噬和调控自噬的关键基因，在很多细胞株发生自噬的模型中都发现Beclin1被诱导表达，但其诱导表达的机制目前尚未明确。另一个自噬调节的中心环节是mTOR激酶途径，其活性受到抑制可激活自噬的发生。mTOR通过调节两条下游通路：核糖体S6蛋白激酶1(S6 kinase-1，S6K1)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(the eIF4E binding protein-1，4EBP1)或通过直接或间接的作用于自噬相关蛋白ATG来调节自噬体的形成，发挥自噬启动门控分子的作用。　　 自噬在机体的生现和病理过程中都能见到，与人类的多种疾病，尤其是恶性肿瘤存在密切关系。此前在肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌中的研究表明肿瘤细胞的自噬活性比其来源的正常细胞的白噬活性要低。在饥饿，缺氧等代谢压力下，细胞基因组的不稳定性增加，如DNA损伤，基因扩增，染色体非整倍性改变，而自噬可以通过限制染色体的不稳定而抑制肿瘤的发生。　　 JNK通路的激活是细胞应激过程中一个常见的事件。JNK信号通路与自噬密切相关。有研究显示IRE1-JNK通路是介导导内质网应激(ER stress)诱导的自噬的关键通路。此外JNK能够通过磷酸化Bcl-2，破坏Bcl-2与beclin1复合体，促进自噬的发生。ATM属于PI3K家族蛋白，是DNA损伤的感应因子。已有研究观察到，在糖饥饿时ATM在生长因子的作用下可激活AMPK诱发自噬。ATM下游重要靶分子P53与自噬关系则更加密切。但是，这两个重要的蛋白激酶在抗肿瘤药物介导的细胞自噬过程中所发挥的作用尚不清楚。　　 在已有的研究基础上，本研究的目的在于深入探讨抗肿瘤药物拓扑替康及神经酰胺通过JNK与ATM介导肿瘤细胞自噬的详细分子机制，进一步阐明自噬在肿瘤发生发展过程中的“双刃剑”作用，充分利用自噬的有利方面，消除不利方面，从而通过调控自噬达到提高肿瘤治疗效果的作用。　　 研究方法：　　 1、用台盼蓝染色实验检测神经酰胺对肿瘤细胞的细胞毒作用；用流式细胞术检测细胞凋亡率；用Western blot方法检测caspase-3、PARP的剪切带；应用免疫荧光、MDC及AO染色检测细胞自噬；用Western blot方法检测JNK、phospho-JNK、c-Jun、phospho-c-Jun以及自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达；用RT-PCR检测LC3及beclin1在mRNA水平的变化；用JNK特异性抑制剂SP600125和siRNA瞬时转染抑制JNK及c-Jun的活性；用染色体免疫沉淀(ChIp)法检测转录因子c-Jun与beclin1启动子序列的特异性结合作用；用荧光素酶报告基因检测c-Jun对beclin1启动子活性的影响。　　 2、用分子克隆技术及脂质体2000介导的转染法建立稳定或瞬时转染质粒的细胞株；用免疫荧光法观察γ-H2AX聚焦点的形成；用共聚焦显微镜术观察YFP-LC3的点状聚集；用Western blot方法检测LC3、P62、Beclin1、Bcl-2、ATM、phospho-ATM及phospho-Beclin1T57蛋白的表达；用ATM特异性抑制剂Ku55933抑制ATM的活性；用免疫共沉淀法检测Beclin1与Bcl-2，Beclin1与ATM的结合作用；用MTT法检测拓扑替康对肿瘤细胞的增殖抑制作用。　　 3、用脂质体2000介导的转染法建立瞬时转染YFP-LC3的细胞株；用共聚焦显微镜术观察YFP-LC3的点状聚集；用Western blot方法检测ATM、phospho-ATM、Beclin1、AMPK、phospho-AMPK、chk2、phospho-chk2、LKB1、P70、phospho-P70、phospho-ACC、P53、sestrin2、CaMKKβ及LC3蛋白的表达；用ATM特异性抑制剂Ku55933、Chk2抑制剂Ⅱ、AMPK特异性抑制剂CompoundC分别抑制ATM、Chk2及AMPK的活性；分别用靶向ATM、P53、sestrin2和AMPK的siRNA瞬时转染抑制上述蛋白的表达；用MTT法检测拓扑替康对肿瘤细胞的增殖抑制作用。　　 结论：　　 1、神经酰胺通过JNK/c-Jun信号通路转录上调白噬相关基因beclin1的表达，诱导Hep3B及CNE2细胞发生自噬性细胞死亡。　　 2、拓扑替康通过ATM介导Beclin1 T57位点发生磷酸化，导致Beclin1/Bcl-2复合体解离，从而诱导Hep3B细胞自噬性死亡。　　 3、在P53野生型的肿瘤细胞中，拓扑替康通过激活ATM/P53/AMPK/mTORC1途径，介导细胞发生保护性自噬。