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研究目的： 研究发现在腹主动脉瘤的患者中可以观察到大量的动脉平滑肌细胞细胞凋亡。而这一现象与炎症的发生有密不可分的联系。（既往动物实验以及临床研究发现，非甾体类抗炎药可以抑制PGE2合成，进而降低腹主动脉瘤中炎症反应与ECM的降解，从而抑制AAA发展。）我们的前期研究表明，PGE2可以上调VSMC中MiR-29b表达。本课题在前期研究基础上，明确PGE2上调VSMC中miR-29b表达后，能否调控VSMC中ECM的合成与分泌，从而探究PGE2以及非甾体类抗炎药在AAA中的作用以及相关机制，为腹主动脉瘤治疗提供新的靶标。更进一步希望通过本课题的开展为将miR-29b或PGE2合成相关基因作为腹主动脉瘤治疗的靶标奠定良好的理论基础。 研究方法： 1.PGE2对miR-29b的影响:通过用500ng/mL的PGE2和10mmol/L非甾体抗炎药物吲哚美辛分别处理体外培养的动脉平滑肌细胞，定量PCR检测细胞内miR-29b的表达情况;进一步地，在大鼠AAA模型的腹主动脉瘤中验证该实验结果。将大鼠分为吲哚美辛治疗的实验组和未经治疗的对照组及假手术组，分别取各组大鼠的动脉瘤组织标本，定量PCR检测其中miR-29b的量。 2.生物信息学预测miR-29b的靶位点，通过双荧光素酶报告基因检测miR-29b是否能够调控预测与其结合位点最多的COL1A1基因的启动子。并采用Western blot方法检测后者在动脉平滑肌细胞中的表达量是否受miR-29b的调控。 3.评估PGE2以及对吲哚美辛血管平滑肌细胞VSMC胞外基质成分（包括胶原蛋白COL1A1、COL3A1、弹力蛋白和纤连蛋白）的作用效果; 4.通过转染miR-29b inhibitor，沉默细胞中miR-29b的表达。从而判断PGE2对细胞外基质的影响是否通过调节miR-29b完成。 5.动物水平的验证:经吲哚美辛治疗的AAA大鼠，检测其腹主动脉瘤组织中可溶性胶原含量并与未治疗的大鼠相比较，评价前列腺素抑制在动物体内的作用。 研究结果： 1.前列腺素E2促使miR-29b表达量增加 用PGE2处理的VSMC中miR-29b的表达量与未处理的细胞相比显著增加(2.162±0.117vs1.004±0.010，P＜0.001)，这与之前的结果严格一致。用吲哚美辛处理细胞后，miR-29b的表达量明显下调，(0.665±0.015vs2.162±0.117，P＜0.01)甚至比未经PGE2处理还要下调(0.665±0.015vs1.004±0.010，P＜0.01)。 经吲哚美辛治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织内miR-29b的量要明显低于未治疗组大鼠，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.miR-29b可以直接靶向调节COL1A1基因 从TargetScan得到的数据结果显示，COL1A1是一个可能的miR-29b下游靶基因，miR-29b与COL1A13-非编码末端(UTR)上的至少三个位点存在相互作用。将COL1A1的3-UTR结合位点序列与miR-29b直接转染细胞中，观察荧光强度变化，判断COL1A1是否能与miR-29b互补结合。在miR-29bmimics存在的情况下，转染有COL1A13-UTR的动脉平滑肌细胞的荧光强度较未转染细胞有很大程度下降，下降到原来的一半左右(P＜0.01);而共转染COL1A13-UTR和Scr-miR的细胞，与未转染细胞相比荧光强度没有显著变化。这说明荧光强度的变化是由miR-29b mimics引起的，由此可以判断，COL1A13-UTR和miR-29b是有直接相互作用的。 进一步通过定量PCR分析方法，评估miR-29b对VSMC中COL1A1表达水平的影响。结果表明，与未转染细胞相比，miR-29b mimics转染的ASMC细胞中COL1A1的表达量在mRNA水平上显著减少且有统计学意义(0.587±0.178VS1.000±duoshao，P＜0.05)。而miR-29b抑制剂则显著增加了COL1A1的表达量(1.630±0.203±duoshao，P＜0.01)。这些结果表明，miR-29b对COL1A1的抑制作用是通过直接靶定其3-UTR序列实现的。采用western blot方法在蛋白水平上验证miR-29b对COL1A1的抑制作用。转染miR-29b mimics的细胞表达COL1A1的量较未转染细胞或转染对照miR-src的细胞表达量低很多;而转染miR-29b inhibitor的细胞中，COL1A1蛋白的表达量明显增加，进一步说明miR-29b对COL1A1表达有抑制作用。 3.前列腺素E2可以通过miR-29b促进VSMC中胞外基质降解 前列腺素E2处理后，COL1A1和COL3A1mRNA表达明显被抑制（分别是处理前的0.690±0.193倍和0.710±0.145倍，P＜0.05）。同样，前列腺素E2也抑制动脉平滑肌细胞中弹性蛋白ELN和纤连蛋白FBN1的表达（分别是原来的0.657±0.105倍和0.643±0.235倍，P＜0.01）。值得注意的是，在吲哚美辛的刺激下各种胞外基质成分的表达水平增强，以对其做出应答。 推测这可能是由于前列腺素E2可以增加miR-29b的表达量，而miR-29b又可以抑制胞外基质胶原基因的表达，进而推测PGE2的作用是否是通过调节miR-29b完成的。首先用RT-PCR检测miR-29b抑制剂对其的抑制效果，结果表明即使在有前列腺素E2存在的情况下，抑制剂也可以成功抑制miR-29b的表达（表达量低于未转染前的30％）。虽然PGE2可以降低胞外基质的表达量，但当转染有miR-29b inhibitor时，其表达量反而是增加的，比不处理的细胞还要高。由此可知，miR-29binhibitor对胞外基质的影响作用较前列腺素要强，之前推测前列腺素E2可能由于增加了细胞内miR-29b的产生，使基质基因表达量下调，而抑制剂不但可以抵抗这种效果，还可以抑制细胞内miR-29b的本底表达量。由此转染有miR-29binhibitor的细胞即使经前列腺素刺激，其miR-29b的水平还是很低，进一步解除了对胞外基质分泌的限制，使胶原和弹性、纤连蛋白等分泌增加。 4.前列腺素E2通过miR-29b降低VSMC中可溶性胶原的分泌 进一步检测由动脉平滑肌细胞分泌可溶性胶原的量加以验证。在前列腺素的刺激下，可溶性胶原的表达量明显下降(P＜0.05)。当用吲哚美辛处理细胞阻碍了细胞本身前列腺素合成的时候，胶原的比例大幅度上升(P＜0.01)。说明PGE2可以调节细胞外基质的合成。转染miR-29b inhibitor时，前列腺素E2的影响被抵消;而转染miR-29b mimics时，前列腺素E2的作用加剧。 5.前列腺素E2抑制剂可以提高大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白含量。 为进一步确认吲哚美辛在动物体内的疗效以及探究其可能的机制，检测了吲哚美辛治疗的AAA大鼠及未经治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白的含量。吲哚美辛治疗的AAA大鼠腹主动脉瘤组织中可溶性胶原蛋白的含量要明显高于未经治疗的大鼠，差异有统计学意义(P＜0.05)。 研究结论： 首先，PGE2对动脉平滑肌细胞中miR-29b的合成有强促进作用。经PGE2抑制剂吲哚美辛治疗后，大鼠体内PGE2的合成受到抑制，从而使miR-29b表达量下降;在动脉平滑肌细胞中，miR-29b可以通过直接结合COL1A13-UTR的结合位点，靶向下调它的表达量。PGE2可以促进动脉平滑肌细胞外基质降解，且PGE2的这种作用是通过调节miR-29b完成的，并且可以被吲哚美辛的作用所拮抗。动物实验进一步表明吲哚美辛在实际应用中可能的用途:通过调节PGE2来改变miR-29b的含量，从而导致细胞外基质中胶原及其他纤维相关蛋白分泌增加。推测，胞外基质的增加可能会通过限制动脉瘤的进一步扩张从而阻碍动脉瘤进展，但本文尚未有确切证据证实此推论，相关的验证实验还在进行。