论文部分内容阅读
痛风性关节炎（GA）是我省、我国乃至全球范围内高发病率的代谢性风湿疾病,严重威胁和影响患者健康及日常生活,其具有相对明确的病程:无症状高尿酸血症（HUA）-急性痛风性关节炎（AGA）-发作间歇期（DIP）-慢性痛风性关节炎（CGA）。AGA是由于患者长期处于HUA状态,造成尿酸钠（monosodium urate,MSU）晶体在关节囊、软骨或关节周边组织沉积,刺激滑液膜产生滑膜血管扩张、通透性增加、白细胞渗出等病理反应从而引起的一类急性炎症反应。目前化药临床治疗GA以秋水仙碱、非甾体抗炎药、糖皮质激素类药物为主,疗效肯定,但通常伴随着不良反应,如耐药性、内源激素抑制和消化道刺激等;中药临床治疗GA主要包括单味饮片、中医经验方和中成药,具有一定疗效,但疗程较长,且往往与化药联合使用,难以对其作用机制进行详细阐述和研究。所以,随着中药现代化研究的深入,针对GA发病的“多层次”特点从天然产物中寻找安全性高、药效作用明确的活性单体并阐明其作用机制是目前GA临床治疗的迫切需求,同时也正是本论文的核心研究任务。本课题组发现白头翁皂苷B4（P-b4）对MSU晶体诱导的关节炎具有较强抗炎活性,故拟以非靶向代谢组学为主要研究手段,结合靶向定量与药理学验证,鉴定P-b4相关药效biomarkers和潜在治疗靶点,明确P-b4对体内“基因-蛋白-代谢物”表达的特异性调控,从分子和细胞水平阐明其抗GA的作用机制,并尝试推断其临床干预GA的最佳介入阶段和治疗终点。本论文药效学研究部分表明P-b4对AGA具有确切的治疗效果且安全无毒（第一章）,同时P-b4干预后的GA大鼠血清代谢组学研究揭示了一个与GA诊断标准相关的重要实际问题:当GA模型组大鼠表面症状（以关节肿胀度和痛阈值为指标）于24小时内自发消退后,32种内源性“药效biomarkers”与急性发作时（6-9小时）依然基本处于同一水平（第二章）。这可能是导致下一次急性发作,甚至持续发作的内在原因。据此,本论文提出科学假说:临床症状的消退或某些生化指标（如血尿酸）的下降并不能作为GA治疗的终点,类似P-b4消除炎症反应的同时将内源性biomarkers回调的现象才是治疗有效性的标志。但目前P-b4的抗GA作用机制尚不明确,将很大程度上影响其后续新药研发和指导临床用药,因此极有必要从体内整体水平阐明P-b4消除GA炎症反应的同时将内源性biomarkers回调的作用机制,并在目前研究阶段中尝试推断P-b4临床治疗痛风性关节炎的最佳阶段和治疗终点。本研究在三年内收集了579名受试者的血清样本,分为训练集（n=379）和验证集（n=200）。所有样本均采用统一标准采集,获得血清生化指标（第三章）。通过一系列的多变量统计分析和相关分析,选取12项血清生化指标作为GA的候选风险因素,首次提出并得到GA的“血清生化轮廓”,可以有效区分GA的不同阶段。由此,笔者认为患者血清生化指标总体水平偏倚到一定程度可能导致某一特定阶段症状的出现。因此,笔者认为应改进以往单一指标的诊断模式,转而采用多指标进行临床综合诊断和预测。在此基础上,建立了5个GA分期（包括健康阶段）的临床诊断模型,并采用多元有序逻辑回归法对其进行了前瞻性检验。接着将验证集数据代入上述模型,输出预测结果并与原始结果进行对比。验证结果证明该临床诊断模型可应用于临床和研究,以提高GA患者病程分期的准确性。同时,本研究提出的“血清生化轮廓”可用于临床GA的辅助诊断和预测（第四章）。采用非靶向代谢组学的方法,应用UPLC-Qtof-MS/MS技术平台识别和鉴定了GA的五个临床阶段中共有的496种“诊断biomarkers”,其中有12种代谢物同时满足以下三个条件,可作为GA病程演化的潜在生物标志物（第五章）:（1）在五个病程阶段显著差异性表达;（2）五个GA病程阶段患者血清中均能检出;（3）在五个病程阶段中具有连续且稳定的上调或下调趋势。同时对与GA病程演化过程相关的关键代谢通路进行了富集与分析,得到了11条关键通路和相关上游蛋白（第五章）。进一步采用靶向代谢组学的方法,应用UHPLC-QE-MS技术平台对已鉴定的12种潜在生物标志物进行精确定量验证（第六章）,并发现Indoleacetic acid、DL-2-aminoadipic acid、kynurenic acid和N1-Methyl-2-pyridone-5-carboxamide在GA的5个阶段中的动态变化最具有规律性,因此我们认为该四种代谢物最具作为GA病程演化潜在生物标志物的前景。以MSU晶体诱导的THP-1细胞作为GA炎症模型,对空白对照组、模型组和P-b4给药组的核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NALP3）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（Caspase-1）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、白细胞介素1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达进行了研究,以此验证经过通路富集得到的代谢通路及靶点（第六章）。以上综合阐明了4种代谢物可将HUA、AGA、DIP、CGA患者与健康对照组进行区分并作为GA不同阶段的准确诊断生物标志物,且结合已鉴定的药效biomarkers和代谢通路分析同时表明P-b4可以显著降低MSU诱导的THP-1细胞中NALP3炎症小体相关蛋白m RNA表达水平,从而抑制NALP3、Caspase-1、ASC的生物合成,进而减少单核细胞对TNF-α、IL-1β、PGE2的释放,最终发挥对GA的药效作用。通过对比496种GA“诊断biomarkers”和32种P-b4“药效biomarkers”,发现GA“诊断biomarkers”囊括了P-b4“药效biomarkers”中的23种,故进一步将五个GA病程患者血清中的该23种共有biomarkers的半定量结果进行提取和分析（第七章）。发现在AGA阶段该23种共有biomarkers与健康对照组具有最显著的差异性表达,且上下调趋势与动物实验结果一致,故笔者据此推测P-b4对GA的临床最佳介入阶段为AGA阶段。在本研究完成后,将继续深入开展P-b4体内其它靶点研究、质量标准研究、制剂研究和药代动力学研究,完善药效和安全性评价,进行新药临床前研究;同时有望继续开发类似“GA诊断试剂盒”的新型GA临床诊断方法,帮助临床医生更快、更准确地预判GA的进展,改善患者的预后。