动脉粥样硬化是动脉的一种炎性、退行性和增生性病变,其病理生理基础在于血管损伤后新生内膜过度增殖及内皮功能不全。EPCs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞。EPCs不仅参与血管形成(angiogenesis),同时也参与出生后血管生成(vasculogenesis)和损伤血管内皮功能的修复,在防治动脉粥样硬化发生发展过程中扮演重要角色。骨髓EPC虽属于早期细胞,其功能和潜质仍不可避免的受到遗传和机体环境的影响,会出现细胞衰老的表现[1、2],不仅修复损伤血管内膜防治动脉粥样硬化的能力下降,甚至会导致血管损伤后新生内膜过度增殖,内皮功能紊乱,促使动脉粥样硬化的发生发展[3、4]。了解影响EPCs衰老因素,明确其影响EPCs活性途径,提高EPCs功能活性,对防治动脉粥样硬化将产生积极的影响。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)是蛋白质、脂质或核酸等大分子与葡萄糖或其它还原单糖通过非酶糖基化反应生成的稳定的共价化合物。血清AGEs水平在高龄、动脉粥样硬化、糖尿病患者中显著升高[5、6]。血清AGEs浓度可作为机体衰老和动脉粥样硬化早期预测的生物学标志[7-10]。AGEs与内皮细胞表面的RAGE结合能促进氧化应激,激活NF-KB,增加血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、组织因子的表达,增加内皮细胞的渗透性,减少一氧化氮(NO)合成,促进单核细胞的黏附和经内皮的迁移,提高促凝活性,促进脂质的浸润[11-14],这些在动脉粥样硬化的发生、发展中起到重要作用。在我们既往的研究中发现老龄大鼠的血清可以抑制年轻供体大鼠骨髓EPCs的活性,而使用年轻供体大鼠的血清则可以提高老龄供体大鼠骨髓EPCs活性,说明老龄大鼠血清中某些成分可以抑制EPCs功能。我们也发现动脉粥样硬化会导致EPCs数量减少、活性减退,且与动脉粥样硬化程度正相关[15],认为某些和动脉粥样硬化相关的物质可能影响EPCs功能导致EPCs衰老。Dernbach等[16]发现EPCs相对于内皮细胞(EC)具有更低的ROS水平,EPCs修复损伤血管的能力与其较低的ROS水平有关,ROS水平升高,EPCs修复损伤血管的活性降低。基于以上研究我们设想AGEs通过RAGE调节细胞内氧化应激影响EPCs衰老,参与动脉粥样硬化发生发展过程。本实验拟使用使用AGEs交联阻断剂ALT711治疗,观察ALT711治疗对不同年龄大鼠骨髓EPCs功能的影响;体外培养骨髓EPCs,验证AGEs对EPCs生物学功能的影响;调节EPCs表面RAGE的表达,研究RAGE表达改变对EPCs衰老的影响。方法:1、使用AGEs交联阻断剂ALT711治疗,观察ALT711治疗对不同年龄大鼠骨髓EPCs功能的影响:3-4月龄、10-12月龄、18-20月龄SD雄性大鼠,随机分为ALT711喂养组和对照组,从骨髓获取单个核细胞并进行体外培养、分化。培养7d后检测各组EPCs迁移、黏附、增殖能力。提取不同年龄段大鼠血清,分为ALT711干预组和对照组培养年轻大鼠骨髓EPCs,培养7d后检测培养的各组EPCs迁移、黏附、增殖能力。探讨供体年龄因素对骨髓内皮祖细胞功能的影响及ALT711对高龄供体骨髓EPCs的活化作用。2、观察不同浓度AGEs对EPCs活性的影响:3-4月龄SD雄性大鼠,从骨髓获取单个核细胞并进行体外培养、分化。培养7d后在EPCs中加入不同浓度AGEs,测定AGEs作用24h后EPCs内活性氧、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量,同时测定EPCs迁移、黏附、增殖能力。探讨AGEs对骨髓EPCs活性的影响。3、观察CRP对EPCs活性的影响:3-4月龄SD雄性大鼠,从骨髓获取单个核细胞并进行体外培养、分化。培养7d后在EPCs中加入不同浓度CRP,测定CRP作用不同时间后EPCs迁移、黏附、增殖能力。探讨CRP对骨髓EPCs活性的影响。4、研究RAGE介导的氧化应激对EPCs功能的影响及在EPCs衰老中的作用:使用不同浓度CRP刺激EPCs,检测CRP对RAGE的上调作用和对AGEs与RAGE结合的协同促进效应;使用脂质体2000转染siRNA到EPCs,检测siRNA对RAGE的下调作用;检测不同RAGE表达状态下EPCs内氧化应激强弱;使用β半乳糖酐酶染色检测EPCs衰老状态。5、研究阻断RAGE表达对颈动脉损伤模型的修复作用:建立颈动脉损伤大鼠切脾模型并随机分为对照组、高表达RAGE移植组和阻断RAGE表达组进行细胞移植,于细胞移植后14d,检测各族颈动脉内膜/中膜比、血管张力。结果:1、分离所得的单个核细胞初为圆形,培养3-5天后可观察到少量梭形贴壁细胞,7-10天后出现大量梭形细胞,并可观察到梭形细胞首尾相连形成条索状结构。用DiI-acLDL及FITC-UEA-I对细胞染色后,通过荧光显微镜观察,染色双阳性细胞(黄色)为正在分化的EPCs。vWF免疫组化染色阳性细胞呈棕黄色;2、将不同年龄组培养EPCs进行迁移、黏附及增殖功能分析,结果提示随供体年龄的增长,骨髓内皮祖细胞迁移、黏附、增殖等功能减退(P<0.01),ALT711治疗可部分恢复年龄相关骨髓EPCs活性;随大鼠年龄增加其血清对骨髓EPCs活性具有抑制作用,加入ALT711干预可以拮抗这种效应。3、AGEs作用后EPCs内活性氧含量明显增加,超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶含量减少,EPCs生物学功能明显减退(P<0.01)。并且这种变化与AGEs浓度成正相关(P<0.01)。4、C反应蛋白作用后骨髓EPCs迁移、黏附和增殖能力明显减退。并且C反应蛋白的这种作用成时间和浓度依赖性,随作用时间延长和/或浓度增加,EPCs功能明显减退(P<0.01)。5、使用不同浓度CRP刺激EPCs可以上调EPCs表面RAGE的表达,增强AGEs与RAGE结合,增强EPCs内氧化应激,促进EPCs衰老(P<0.01)。使用脂质体2000转染siRNA阻断RAGE可以削弱上诉作用(P<0.01)。6、不同细胞移植对大鼠颈动脉修复有明显差异,低RAGE表达组修复颈动脉损伤程度明显优于高RAGE表达组(P<0.01)。结论:1、供体年龄对骨髓EPCs有影响,随供体年龄增长骨髓EPCs迁移、黏附、增殖等功能减退。ALT711干预可以改善供体增龄导致的EPCs活性减退,拮抗老年供体血清对EPCs活性的负性调节效应;2、AGEs促进EPCs内活性氧生成,减少抗氧化酶的合成,增强氧化应激,破坏细胞内环境稳定性,使细胞生物学功能受损,并且这种变化与AGEs浓度成正相关;3、CRP对骨髓EPCs活性有影响,随CRP浓度和作用时间增加骨髓EPCs迁移、黏附、增殖等功能受损;4、CRP成浓度依赖性调节EPCs内RAGE表达,增强AGEs的作用;5、RAGE表达改变可影响EPCs内氧化应激,改变骨髓EPCs功能,促进EPCs衰老。低表达RAGE的EPCs修复损伤内膜恢复血管功能的能力明显优于高表达RAGE的EPCs。