目的:预测、筛选及合成尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性细胞毒性T细胞表位,并进行初步鉴定。方法:(1)表位预测、分子动力学模拟、表位肽的合成:运用BIMAS、SYFPEITHI、Predep和Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB)软件预测EWS-FLI1可能的HLA-A2.1限制性CTL表位。应用多项式方案、量化基序方案对预测的CTL表位进行筛选,并将筛选的表位与HLA-A2.1分子进行动力学模拟。根据预测、筛选的结果,按标准Fmoc方案合成抗原多肽,并纯化、鉴定。(2)表位肽刺激的CTL产生颗粒溶素的检测:分离收集健康人外周血PBMC,鉴定HLA-A2.1阳性表达,进行DC诱导,制备尤文肉瘤冻融抗原冲击致敏的DC(TP-DC)。制备效应细胞。采用ELISA定量测定抗原肽刺激的效应细胞所产生颗粒溶素(Granulysin)的能力。(3)效应细胞对靶细胞的杀伤作用的检测:以尤文肉瘤A673为靶细胞,按不同的效靶比将效应细胞与A673共育,乳酸脱氢酶ELISA检测杀伤率。结果:1.结合BIMAS、SYFPEITHI、Predep和IEDB预测EWS-FLI1可能的HLA-A2.1限制性CTL表位,共8个。经多项式方案、量化基序方案进一步筛选,确定其中4个肽为候选表位肽。2.应用分子动力学模拟,初步验证了4个候选表位肽与HLA-A2.1分子的结合力。色谱测定各候选肽的纯度均在以98%以上,质谱分析各肽的分子量与理论值相符。3.颗粒溶素释放实验证实筛选的4条表位肽均能产生刺激效应,其中表位肽QIQLWQFLL(EWS-FLI1 304)的刺激效应最为显著。4.靶细胞杀伤实验证实筛选的表位肽均能产生杀伤效应, QIQLWQFLL(EWS-FLI1 304)尤文肉瘤细胞具有较强的杀伤作用,且随效靶比升高,杀伤率递增。结论:1.综合运用多个方案可提高预测效率,分子动力学模拟可初步验证表位肽与HLA-A2.1分子的结合力。2.颗粒溶素释放实验和乳酸脱氢酶实验初步鉴定了QIQLWQFLL是EWS-FLI1蛋白的HLA-A2.1限制性CTL表位。