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目的:观察DUSP8在结直肠癌(colorectal carcimona,CRC)临床标本中的表达和意义以及与微卫星不稳定(MSI)的关联性;研究DUSP8对人MSI-H型和MSS型CRC细胞生长和凋亡的影响和相关机制。方法:1.免疫组化检测人结直肠癌组织芯片中DUSP8在癌组织和癌旁组织的表达,根据DUSP8表达量进行免疫组织化学评分(H-Score),并对其进行K-S正态性检验后分为DUSP8高表达组和低表达组;分别对两组患者DUSP8的表达与相关临床指标进行相关性分析和卡方检验,并利用Kaplan-Meier法分析两组患者的5年生存率;Cox单因素和多因素回归分析法分析影响结直肠癌患者5年生存的总因素;通过TCGA数据库进一步分析DUSP8与结直肠癌微卫星稳定的关系;免疫组化检测人结直肠癌组织芯片中错配修复蛋白MLH1,MSH2和MSH6的表达,并根据相应蛋白表达缺失与否将患者分为MSS组和MSI-H组,Kaplan-Meier法分析两组患者的5年生存率;进一步根据DUSP8 H-Score分别用Cox单因素和多因素回归分析法分析MSI-H和MSS组中DUSP8表达的临床意义;免疫荧光和Western Blot技术检测FHC,HCT116,SW480和SW620细胞中内源性DUSP8、错配修复蛋白MLH1,PMS2,MSH2和MSH6的表达。2.利用Lipofectamine 3000纳米阳离子脂质体把前期实验中构建好的p-DUSP8过表达质粒和p-EGFP对照质粒,分别体外瞬时转染MSI型HCT116细胞和MSS型SW620细胞;48h后收集细胞,倒置荧光显微镜观察质粒转染效率;CCK8法检测转染后24h,48,72,96h和120h的细胞增殖情况;克隆形成检测细胞克隆能力;免疫荧光检测细胞Ki-67的表达,TUNEL原位细胞凋亡的改变,线粒体膜电位JC-1的变化以及线粒体活性氧ROS的产生;流式细胞术检测细胞凋亡的比例和细胞周期的改变。3.分别建立HCT116和SW620人结直肠癌细胞裸鼠移植瘤模型,于模型建立后分为HCT116组(n=12)和SW620组(n=16),HCT116组又随机分为p-EGFP组(n=6)和p-DUSP8组(n=6),SW620组随机分为p-EGFP组(n=8)和p-DUSP8组(n=8)。在肿瘤局部分别用Entranster以注射的方式体内转染试剂转染12.5μg p-EGFP和12.5μg p-DUSP8质粒,每隔3天注射一次,共注射3次,并每3天测量肿瘤大小,末次注射3天后,七氟烷麻醉收集眼球血后处死移植瘤小鼠,剥取其肿瘤组织和肺组织,分别用活体成像观察肿瘤局部质粒转染效率和肿瘤细胞肺组织的转移情况;免疫荧光检测肿瘤组织DUSP8的表达、Ki-67的表达和TUNEL细胞凋亡的改变;HE染色观察小鼠肿瘤组织、肺组织和心脏、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织的组织形态学改变。4.利用Lipofectamine 3000纳米阳离子脂质体把前期实验中构建好的p-DUSP8过表达质粒和p-EGFP对照质粒,分别体外瞬时转染MSI型HCT116细胞和MSS型SW620细胞;48h后收集细胞提取全蛋白,Western Blot检测DUSP8可能的去磷酸化底物p-JNK1/2,p-ERK1/2,p-p38,与生长和凋亡相关蛋白Cyclin D1,CDK4,p53,p21,p-Rb以及p-JNK1/2,p-ERK1/2,p-p38激酶所激活的相关底物c-Fos,c-Jun,p-c-Fos,p-c-Jun,p-p53和c-Myc的表达;进一步利用STRING数据库预测可能与DUSP8发生相互作用的蛋白,整合ZDOCK Server数据库,对筛选出的互作蛋白与DUSP8进行刚性对接,判断互作关系,并用Co-IP实验进一步验证靶蛋白与DUSP8的相互作用。结果:1.人结直肠癌组织芯片结果显示:DUSP8在93例癌组织和87例癌旁组织中均有表达,但表达量无统计学差异(P>0.05);DUSP8免疫组化评分H-Score的范围为0.125~86.92,并根据H-Score对其进行K-S正态性检验发现DUSP8在癌组织和癌旁组织的表达量不符合正态分布(P<0.05);依据DUSP8 H-Score的中位数41.32,将93例病人分为DUSP8高表达组(46例)和DUSP8低表达组(47例),DUSP8的表达在年龄、性别、组织学分化、病理学类型、肿瘤体积大小、TN分期和临床分期方面两组间均无明显差异(P>0.05);而M分期中,DUSP8低表达组M1期患者为4例,而DUSP8高表达组为0例,差异具有统计学意义(P<0.05);Kaplan-Meier法分析发现两组患者5年生存率无明显统计学差异(P>0.05);Cox回归分析法表明,肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移与结直肠癌患者的5年生存有关(P<0.05),而肿瘤大小和TNM分期是影响患者5年生存的独立因素(P<0.05)。TCGA数据库结果显示在327例结直肠癌患者中,DUSP8在癌组织和癌旁组织的表达无明显差异(P>0.05);在不同年龄、性别、临床分期、人种和体重的患者中DUSP8表达也无显著差异(P>0.05);在微卫星稳定(MSS)方面:组织芯片结果表明93例患者中,有17例存在MLH1或MSH2和MSH6的表达缺失,属于MSI-H结直肠癌,而76例为MSS结直肠癌;Kaplan-Meier法分析发现发现MSI-H结直肠癌较MSS结直肠癌5年生存率明显延长,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);MSI-H结直肠癌组织中DUSP8mRNA的表达明显低于MSS结直肠癌(P<0.05)。在MSI-H结直肠癌中,DUSP8的表达与患者的肿瘤体积大小及5年生存率有关(P<0.05),而与患者的TNM分期和临床分期无关(P>0.05)。在MSS结直肠癌中,DUSP8的表达与患者的肿瘤体积大小、NM分期、临床分期和5年生存率密切相关(P<0.05),而与患者的T分期无明显关系(P>0.05)。此外,Cox回归分析法表明,在MSS结直肠癌中,DUSP8表达水平、TNM分期和远处转移与结直肠癌患者的5年生存有关(P<0.05),且DUSP8的表达、肿瘤大小和TNM分期是影响患者5年生存的独立因素(P<0.05)。Western Blot和免疫荧光显示:HCT116细胞为MSI-H型,FHC,SW480和SW620细胞为MSS型;HCT116细胞中内源性DUSP8的蛋白表达显著高于其他细胞(P<0.05),而SW480细胞中p-JNK1/2,p-ERK1/2和p-p38的内源性表达则高于其他细胞(P<0.05)。2.荧光观察发现:p-EGFP转染组和p-DUSP8组细胞中EGFP均有较高表达;CCK8和克隆形成结果显示:与p-EGFP组相比,p-DUSP8组HCT116细胞增殖和克隆形成显著加快(P<0.05),而SW620细胞增殖和克隆形成明显减弱(P<0.05);免疫荧光结果显示:与p-EGFP组相比,p-DUSP8组HCT116细胞Ki-67表达显著增加(P<0.05),而细胞凋亡明显减少(P<0.05),线粒体膜电位JC-1红色荧光增加,线粒体ROS产生明显减少;SW620细胞则Ki-67表达显著下调(P<0.05),细胞凋亡明显增加(P<0.05),线粒体膜电位JC-1绿色荧光增多,线粒体ROS产生明显上调;流式细胞术结果显示:与p-EGFP组相比,p-DUSP8组HCT116细胞细胞凋亡比例显著减少(P<0.05),而SW620细胞细胞凋亡比例明显增加(P<0.05);细胞周期分析结果显示:p-DUSP8组HCT116细胞G0/G1期比例下调(P<0.05),S期比例上调(P<0.05),G2/M期比例下调(P<0.05),而SW620细胞G0/G1期比例上调(P<0.05),S期比例下调(P<0.05),G2/M期比例上调(P<0.05)。3.动态观察人结直肠癌HCT116和SW620细胞裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长,记录并绘制肿瘤生长曲线。结果显示:与p-EGFP对照组相比,p-DUSP8实验组HCT116移植瘤模型肿瘤生长较快(P<0.05),且活体成像表明肿瘤大小与局部富集的荧光信号强度成正比,肺组织中转移的肿瘤细胞浸润较明显,而SW620移植瘤模型肿瘤生长较慢(P<0.05),且活体成像表明肿瘤大小与局部富集的荧光信号强度成反比,肺组织中转移的肿瘤细胞浸润较少;免疫荧光结果发现HCT116和SW620移植瘤模型p-DUSP8实验组肿瘤组织中DUSP8均有明显的高表达;而与p-EGFP对照组相比,p-DUSP8实验组HCT116肿瘤组织局部Ki-67表达显著增加(P<0.05),TUNEL细胞凋亡明显减少(P<0.05),但SW620肿瘤组织局部Ki-67表达显著降低(P<0.05),TUNEL细胞凋亡明显增加(P<0.05);HE染色结果显示:与p-EGFP对照组相比,p-DUSP8实验组HCT116和SW620移植瘤模型心脏、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织无明显病理学改变。4.Western Blot结果显示:与p-EGFP组相比,p-DUSP8组HCT116细胞中DUSP8表达显著上调(P<0.05),其可能的去磷酸化底物p-JNK1/2表达明显下调(P<0.05),而p-ERK1/2表达上调(P<0.05),p-p38表达无明显差异(P>0.05);生长和凋亡相关蛋白CDK4和p-Rb的表达较p-EGFP组显著上调(P<0.05),p21表达明显下调(P<0.05),而Cyclin D1和p53表达无明显变化(P>0.05);p-JNK1/2,p-ERK1/2,p-p38激酶所激活的相关底物c-Fos,c-Jun和p-c-Fos无明显差异(P>0.05),而p-c-Jun和p-p53相比于p-EGFP组显著下调(P<0.05),c-Myc的表达明显上调(P<0.05);同时,与p-EGFP组相比,p-DUSP8组SW620细胞中DUSP8表达显著上调(P<0.05),但其可能的去磷酸化底物p-JNK1/2,p-ERK1/2和p-p38的表达显著下调(P<0.05);生长和凋亡相关蛋白Cyclin D1和CDK4的表达较p-EGFP组显著下调(P<0.05),而p53,p-Rb和p21的表达无明显变化(P>0.05);p-JNK1/2,p-ERK1/2,p-p38激酶所激活的相关底物c-Fos,c-Jun,p-c-Jun和p-p53的表达无明显差异(P>0.05),而p-c-Fos和c-Myc的表达相比于p-EGFP组明显下调(P<0.05)。分子模拟和对接结果显示:DUSP8(PDB:4JMK)与MAPK1(ERK2,PDB:4S31),MAPK8(JNK1,PDB:3PZ1),MAPK11(p38α,PDB:3GP0)和MAPK14(p38β,PDB:5ETI),存在互作,且该互作关系为直接相互作用,而与MAPK3(ERK1,PDB:2ZOQ)没有相应的对接区域。最后,Co-IP结果显示,在HCT116细胞和SW620细胞中,DUSP8可以和内源性p-JNK1/2结合。结论:1.DUSP8的表达与临床结直肠癌微卫星稳定密切相关。2.DUSP8过表达促进MSI-H型结直肠癌细胞体内、外生长和抑制凋亡,但抑制MSS型结直肠癌细胞体内、外生长并促进凋亡。3.DUSP8过表达对MSI-H型和MSS型结直肠癌细胞生长和凋亡效应的差异性与在不同类型细胞中去磷酸化底物p-JNK1/2,ERK1/2和p-p38差异性相关。